말라리아 감염 시 세포 외 기 기능의 평가

요약

이 작품에서는, 우리는 변형 체 falciparum 감염 적혈구에 의해 발표 하는 extracellular 소포 (EVs)의 역할을 조사 하기 위해 프로토콜 설명 합니다. 특히, 우리는 내 피 세포와 EVs의 상호 작용에 초점.

초록

말라리아는 변형 체 기생충으로 인 한 생명이 질병, P. falciparum 되 가장 아프리카 대륙에서 우세 하 고 대부분 말라리아 관련 사망자에 대 한 책임 세계적으로. 조직, 혈관 부전, 및 염증 응답 기생충 격리 등 여러 가지 요인 말라리아에 감염 된 사람들에 있는 질병의 진화에 영향. P. falciparum-감염 된 적혈구 (iRBCs) 출시 작은 extracellular 소포 (EVs) 기생충과 호스트 사이의 pathogenesis 및 휴대 통신을 중재 하는 화물 분자의 다른 종류를 포함. EVs는 효율적으로 있는 그들은 그들의 기능을 조절 하는 세포에 의해 촬영. 여기 우리는 기생충-호스트 상호 작용에서 EVs의 역할을 해결 하기 위해 전략을 논의. 첫째, 우리는 녹색 셀 링커 염료를 사용 하 여 레이블 및 내 피 세포에 의해 EV 국제화를 추적 간단 방법을 설명 합니다. 둘째, 우리 보고 붙일 레이블된 dextran을 사용 하 여 내 피 세포 단층에서 침투성을 측정 하는 간단한 방법. 마지막으로, 우리 내 피 세포 기능에 작은 비 코딩 RNA 분자의 역할을 조사 하는 방법을 보여 줍니다.

서론

세계 보건 기구에 따르면 말라리아의 212 백만 새로운 경우 2015 년에 전세계 있었고 약 429,000 명이 사망, 주로 어린이 나이¹의 5 년. 종종 연관 된 혈관 부전, 심한 질병으로 이어지는 메커니즘 남아 병이 정의². 변형 체iRBCs extracellular 소포 (EVs)로 알려진 작은 이중 지질 막 분야 분 비. 그것은 알려져 이러한 EVs는 잠재적으로 관련 감염 프로세스 및 호스트 면역 반응 감염; 그러나, 약간 말라리아 감염³동안 이러한 작은 소포의 정확한 기능에 대 한 알려져 있다. 그들은 두 가지 중요 한 역할을 재생 가능: 한 반면에, 그들은 수 있습니다 기여할 병 인 세포^4,5;를 활성화 하 여 그리고 다른 한편으로, 그들은 셀룰러 통신 기생충 및 기생충과 호스트^6,7을 중재할 수 있습니다. 사실, EVs를 통해 서로 간의 기생충 단백질 또는 핵 산을 전송할 수 있습니다. 예를 들어 Trypanosoma br....

프로토콜

인간의 Rbc는 Swissethics (swissethics.ch)의 지침에 따라 건강 한 기증자의 혈액에서 얻은 했다.

참고: P. falciparum 기생충 문화 (3D 7)와 EV 생산은 이전에 설명 된 Mbagwu, 외 알. ¹¹ P. falciparum 인간의 병원 체 이기 때문에 처리에 대 한 현지 규정을 참조 하십시오. 문화는 유지 되어야 한다 살 균 전체 시간.

1. 형광 EVs의 라벨

참고: 다음 절차는 EV 막의 지질 지역에서 큰 지방 족 꼬리와 안정적으로 녹색 형광 염료 (PKH67)를 통합 하는 라벨 기술 이용 합니다. 반응은 200 µ L PKH67의 20 µ M 최종 농도 포함 하는 볼륨을 얼룩 마지막에 수행 됩니다. 주위 온도 (20-25 ° C)에서 모든 단계를 수행

1. 장소 100 µ g EVs의 microcentrifuge 튜브에 PBS의 1 mL에.
2. 펠 렛를 7 분에 대 한 최대 속도 (20000 x g) microcentrifuge 관에서 EVs 원심
   참고: 말라리아 EVs에 존재 ....

결과

여기, 우리 호스트 셀 EVs의 상호 작용을 조사 하는 프로토콜을 설명 합니다. 붙일 레이블된 EVs의 글귀는 confocal 현미경 검사 법 (그림 1)에 의해 모니터링 됩니다. 그러나 내 피 세포 효율적으로 차지 EVs, EVs와 보육 시간 통풍 관을 추적 하기 위해 낙관 될 수 있다. 셀 내부 EVs의 더 나은 지역화, phalloidin와 말라 얼룩. 다음, 우리는 내 피 세포의 단층 성장 필터 멤브레인을 사용 합니다. Rhodamine B isothiocyanate-dextran 필터 멤브레인의 최고 약 실에 적용 하 고 내 피 단층의 침투성 바닥 챔버 (그림 2A)에 형광 dextran의 전송을 모니터링 하 여 측정 된다. 일반적으로, 내 피 세포의 침투성은 EVs (그림 2B)의 증가 금액으로 부 화.......

토론

Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania, Trichomonas 등 여러 기생충 감염 된 주인 세포에 의해 EVs의 석방을 트리거합니다. 병원 체에 따라 출시 된 EVs 호스트 면역 반응을 조절 하거나 기생충⁶사이 셀룰러 통신을 중재 수 있습니다. 그러나, 이러한 작은 소포 말라리아 질병에 기여 하는 방법을 제안 하는 조금 기록이 있다. 여기, 우리는 변형 체 감염 동안 EVs의 기능을 조사 하기 위해 여러 가지 방법으로 설명 했습니다. 예를 들어, 받는 사람 세포 vivo에서 EVs의 통풍 관의 라벨 PKH67 형광 염료와 효율적으로 모니터링할 수 있습니다. 여러 컨트롤 라벨의 특이성을 보장 하기 위해 수행 해야 합니다. 그것은 일단 희석제 C와 혼합, PKH67 염료 양식 집계 하는 경향이 있다 그리고 그것은 일반적인 얼룩 확인 하려면 EVs 없이 혼자 염료를 사용 하 여 컨트롤을 포함 하는 데 필요한 따라서 중요. Confoc.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PKH67 녹색 형광 세포 링커 미니 키트	Sigma-Aldrich	MINI67-1KT
희석제 C	Sigma-Aldrich	G8278
폴리-L-라이신	Sigma-Aldrich	P8920
PBS	ThermoFisher - Gibco	10010023
Phalloidin CF594	Biotium	#00045
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36934
Rhodamine B isothiocyanate– Dextran	ThermoFisher	R9379-250MG
PET 막 투명 Falcon 삽입물  플레이트 24 웰	Falcon	353095
내피 세포 성장  중간 MV	Promocell	C-22020
Puromycin dihydrochloride	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
MTS 세포 증식 색량 분석 키트	Biovision	K300-500
hexadimethrine bromide	Sigma-Aldrich	107689-10G
MISSION  Lenti microRNA, Human has-miR-451a	Sigma-Aldrich	HLMIR0583
MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction	Particles Sigma-Aldrich	NCLMIR001
MISSION  Lenti microRNA, Human	Sigma-Aldrich	NCLMIR0001
Leica TCS SP5	Leica Microsystems
miRNeasy 미니 키트	Qiagen	217004
TaqMan MicroRNA 역전사 키트 1000 반응	ThermoFisher	4366597
has-mir-451a  RT/750 PCR rxns	ThermoFisher	001141
U6 snRNA	ThermoFisher	001973
TaqMan Universal Master Mix II, with UNG	ThermoFisher	4440038
StepOnePlus Real-Time PCR System	ThermoFisher	4376600