मलेरिया संक्रमण के दौरान Extracellular पुटिका समारोह का मूल्यांकन
Summary
इस काम में, हम प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए extracellular बुलबुले की भूमिका की जांच (ईवीएस) द्वारा जारी प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स । विशेष रूप से, हम endothelial कोशिकाओं के साथ ईवीएस की बातचीत पर ध्यान केंद्रित ।
Abstract
मलेरिया एक जीवन की धमकी प्लाज्मोडियम परजीवी की वजह से बीमारी है, पी फाल्सीपेरम के साथ सबसे अधिक प्रचलित अफ्रीकी महाद्वीप और सबसे मलेरिया से संबंधित मौतों के लिए दुनिया भर में जिंमेदार होने के साथ । ऊतकों में परजीवी ज़ब्ती सहित कई कारकों, संवहनी रोग, और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं मलेरिया संक्रमित लोगों में रोग के विकास को प्रभावित. P. फाल्सीपेरम-संक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं (iRBCs) छोटे extracellular बुलबुले जारी (ईवीएस) परजीवी और मेजबान के बीच रोगजनन और सेलुलर संचार मध्यस्थता कि कार्गो अणुओं के विभिन्न प्रकार से युक्त. ईवीएस कुशलता से उन कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है जिनमें वे अपने कार्य को व्यवस्थित करते हैं । यहां हम रणनीति पर चर्चा के लिए परजीवी में ईवीएस की भूमिका का पता-मेजबान बातचीत । सबसे पहले, हम लेबल और endothelial कोशिकाओं द्वारा EV internalization ट्रैकिंग के लिए एक सीधी विधि का वर्णन, एक हरे रंग की सेल linker डाई का उपयोग कर । दूसरा, हम एक फ्लोरोसेंट लेबल dextran का उपयोग करके एक endothelial सेल monolayer भर में पारगम्यता को मापने के लिए एक सरल तरीका रिपोर्ट. अंत में, हम endothelial सेल समारोह में छोटे गैर कोडिंग आरएनए अणुओं की भूमिका की जांच करने के लिए कैसे दिखा ।
Introduction
विश्व स्वास्थ्य संगठन के अनुसार, दुनिया भर में २०१५ में मलेरिया के २१२,०००,००० नए मामले थे और लगभग ४२९,००० लोगों की मृत्यु हुई, जिनमें मुख्य रूप से पांच वर्ष से कम आयु के बच्चे1हैं । गंभीर रोग है, जो अक्सर संवहनी रोग के साथ जुड़ा हुआ है के लिए अग्रणी तंत्र, बीमार2परिभाषित रहते हैं । प्लाज्मोडियम-iRBCs स्रावित छोटे द्वि-लिपिड झिल्ली extracellular बुलबुले (ईवीएस) के रूप में जाना क्षेत्रों । यह ज्ञात है कि इन ईवीएस संभावित संक्रमण की प्रक्रिया के लिए और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया करने के लिए प्रासंगिक है संक्रमण; हालांकि, थोड़ा मलेरिया के संक्रमण के दौरान इन छोटे बुलबुले के सटीक समारोह के बारे में जाना जाता है3। यह संभव है कि वे दो महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं: एक तरफ, वे मैक्रोफेज को सक्रिय करके रोगजनन में योगदान दे सकते है4,5; और दूसरी ओर, वे परजीवी के बीच और परजीवी और मेजबान6,7के बीच सेलुलर संचार मध्यस्थता हो सकता है. वास्तव में, परजीवी ईवीएस के माध्यम से एक दूसरे के बीच प्रोटीन या न्यूक्लिक एसिड हस्तांतरण कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, Trypanosoma brucei rhodesiense ईवीएस डाह फैक्टर सीरम प्रतिरोध-संबद्ध (SRA) स्थानांतरित कर सकते हैं, और अन्य टी. brucei और होस्ट एरिथ्रोसाइट्स8दोनों को लक्षित कर सकते हैं । इसके अलावा, P. फाल्सीपेरम-iRBCs न्यूक्लिक एसिड को ईवीएस के भीतर स्थानांतरित करके एक दूसरे के बीच संवाद करता है । यह परजीवी अनुकूलन और इसके विकास को सिंक्रनाइज़ करने के लिए अनुमति देता है । वास्तव में, ईवीएस gametocyte रूपांतरण का प्रमुख नियामक हो सकता है, और इसलिए पारेषण चरण7के नियमन में योगदान देता है ।
न केवल ईवीएस परजीवी को विनियमित करते हैं, वे भी परजीवी मेजबान बातचीत मध्यस्थता । हमें हाल ही में पता चला है कि iRBCs से ईवीएस में मेजबान-व्युत्पंन microRNAs (miRNAs; 21-25 न्यूक्लियोटाइड की सीमा में छोटी आरएनए प्रजातियां शामिल हैं, जो मानव endothelial कोशिकाओं द्वारा ली गई थी । ईवीएस में miRNAs Ago2 के साथ एक स्थिर परिसर फार्म (आरएनए-प्रेरित मुंह बंद करने परिसर के एक सदस्य), जो एक बार प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को दिया, विशेष रूप से मुंह बंद करने जीन अभिव्यक्ति में सक्षम है और कोशिकाओंकीबाधा गुण 10 को प्रभावित. मानक प्रोटोकॉल ईवीएस के समारोह की जांच करने के लिए विकसित किया गया है । यहां, हम पहले एक प्रोटोकॉल है कि ईवीएस के फ्लोरोसेंट लेबलिंग की अनुमति देता है का वर्णन करने के लिए प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा उनके ऊपर की जांच । इसके अलावा, एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, यह सेल के अंदर EV भाग्य ट्रैक करने के लिए संभव है । कई फ्लोरोसेंट रंजक ईवीएस ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अमीन-प्रतिक्रियाशील डाई, 5-(और-6)-Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl एस्टर (CFSE) और Calcein-एक बार बुलबुले के अंदर फ्लोरोसेंट बन गया है । हम amphiphilic लेबल, PKH, का उपयोग करना पसंद करते हैं, क्योंकि यह एक उज्जवल और अधिक वर्दी संकेत देता है । यह approach ईवीएस और प्राप्तकर्ता कक्षों के बीच सहभागिता को समझने के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है । जबकि कुछ मामलों में कोशिकाओं की सतह के लिए ईवीएस बांध, कुछ बुलबुले तेजी से ले रहे हैं । पर, ईवीएस कोशिकाओं है, जिसमें वे अपने विनियामक कार्य लागू करने के लिए अपने माल उद्धार ।
यहाँ, हम एक सेलुलर monolayer के माध्यम से एक फ्लोरोसेंट dextran के हस्तांतरण को बढ़ाता है द्वारा इन विट्रो में endothelial कोशिकाओं के बैरियर समारोह को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. अधिक संवेदनशील अनुरेखक ऐसे radiolabeled मार्करों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, वे उपयोग के लिए विशेष सुरक्षा सावधानियों की आवश्यकता होती है । अंय परख इस तरह के transendothelial विद्युत प्रतिरोध (तीळ), जो तंग जंक्शन अखंडता के उपाय के रूप में इन विट्रो बाधा समारोह में मापने के लिए मौजूद हैं । अंत में ZO-1, एक तंग जंक्शन प्रोटीन visualizing, इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा तंग जंक्शन अखंडता के आकलन के रूप में अच्छी तरह से10की अनुमति देता है । चूंकि ईवीएस जटिल और विषम इकाईयां है जिनमें संभावित विनियामक विशेषता के साथ कई कार्गो हैं, यह प्राप्तकर्ता कोशिका पर इसके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक विशिष्ट आरएनए को अभिव्यक्त करने के लिए उपयोगी है । इसलिए, हम भी एक प्रोटोकॉल है कि स्थिर सेल लाइन के लिए ब्याज की miRNA व्यक्त उत्पंन करने का लक्ष्य परिभाषित10।
Protocol
Representative Results
Discussion
Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania सहित कई परजीवी, और ट्रायकॉमोनास संक्रमित मेजबान सेल द्वारा ईवीएस की रिहाई ट्रिगर । रोगजनकों पर निर्भर करता है, जारी ईवीएस मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को मिलाना या परजीवी6के ब…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के भाग में वित्तीय नोवार्टिस फाउंडेशन द्वारा चिकित्सा के लिए समर्थन किया गया था और जैविक अनुसंधान (PYM के लिए), Gottfried और जूलिया Bangerter-Rhyner-Stiftung (मेगावाट और PYM के लिए), और Fribourg विश्वविद्यालय के अनुसंधान पूल (करने के लिए PYM). अतिरिक्त अनुदान स्विस सरकार विदेशी विद्वानों के लिए उत्कृष्टता छात्रवृत्ति (KAB और एसएम के लिए) शामिल हैं । हम तकनीकी सहायता के लिए इसाबेल साहब और Solange Kharoubi हेस धंयवाद ।
Materials
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher – Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
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