Evaluering af ekstracellulære vesikel funktion under Malaria infektion
Summary
I dette arbejde beskriver vi protokoller for at undersøge den rolle af ekstracellulære vesikler (EVs) udgivet af Plasmodium falciparum inficeret erytrocytter. Især fokuserer vi på samspillet mellem evt med endotelceller.
Abstract
Malaria er en livstruende sygdom forårsaget af Plasmodium parasitter, med P. falciparum er den mest fremherskende på det afrikanske kontinent og ansvarlig for de fleste malaria-relaterede dødsfald globalt. Flere faktorer, herunder parasit binding i væv, vaskulær dysfunktion og inflammatoriske reaktioner påvirke udviklingen af sygdommen i malaria-inficerede mennesker. P. falciparum-inficerede røde blodlegemer (iRBCs) frigive små ekstracellulære vesikler (EVs) indeholder forskellige former for last molekyler, der mægle patogenese og trådløse kommunikation mellem parasitter og vært. Evt er effektivt taget af celler, hvor de modulere deres funktion. Her kan vi diskutere strategier for at afhjælpe evt rolle i parasit-værtssammenspil. Først, vi beskriver en enkel metode for mærkning og sporing EV internalisering af endotelceller, ved hjælp af en grøn celle linker farvestof. Andet, rapporterer vi en enkel måde at måle permeabilitet på tværs af en endotel celle éncellelag ved hjælp af en fluorescently mærket dextran. Endelig vil vise vi hvordan du undersøge rollen, som små ikke-kodende RNA molekyler i endothelial cellefunktion.
Introduction
Ifølge World Health Organization, der var 212 millioner nye tilfælde af malaria på verdensplan i 2015 og døde ca 429,000 mennesker, især børn under fem år af alder1. De mekanismer, der fører til alvorlig sygdom, der ofte er forbundet med vaskulær dysfunktion, forbliver uklare2. Plasmodium– iRBCs udskiller lille bi-lipid membranen kugler kendt som ekstracellulære vesikler (EVs). Det er kendt at disse evt er potentielt relevant for infektion oparbejde og immunrespons vært til infektion; dog er lidt kendt om den eksakte funktion af disse små blærer under malaria infektion3. Det er muligt, at de spiller to vigtige roller: på den ene side kan de bidrage til patogenesen ved at aktivere makrofager4,5; og på den anden side de kunne mægle cellulære kommunikation mellem parasitter og parasitter og vært6,7. I virkeligheden, kan parasitter overføre proteiner eller nukleinsyrer mellem hinanden via evt. For eksempel, Trypanosoma brucei rhodesiense evt-kan overføre virulens faktor Serum Resistance-Associated (SRA), og kan målrette både andre T. brucei og vært erytrocytter8. Derudover kommunikation P. falciparum– iRBCs mellem hinanden ved at overføre nukleinsyrer inden for evt. Dette giver mulighed for parasitter at optimere og synkronisere sin vækst. Faktisk kunne evt være den store regulator af gametocyte konvertering, og derfor bidrager til reguleringen af transmission etape7.
Ikke kun gøre evt regulere parasitter, de også mægle parasit-værtssammenspil. Vi har for nylig opdaget, at elbiler fra iRBCs indeholder vært-afledte MicroRNA (miRNAs; små RNA arter i rækken af 21-25 nukleotider9), blev taget op af menneskelige endotelceller. MiRNAs i den europæiske volontørtjeneste udgør en stabil kompleks med Ago2 (medlem af RNA-induceret silencing complex), som når leveres til de modtagende celler, er i stand til at specifikt silencing genekspression og påvirker barriereegenskaber celler10. Standardprotokoller er blevet udviklet for at undersøge funktionen af evt. Her beskriver vi først en protokol, der tillader de fluorescerende mærkning af evt at undersøge deres udbredelse af modtagerens celler. Derudover ved hjælp af en Konfokal mikroskop, er det muligt at spore den EV skæbne inde i cellen. Flere fluorescerende farvestoffer kan bruges til at spore evt. Amine-reaktiv farvestof, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein diacetat Succinimidyl Ester (CFSE) og Calcein-AM bliver fluorescerende når inde vesikler. Vi foretrækker at bruge etiketten amphiphilic, PKH, fordi det giver en lysere og mere ensartet signal. Denne tilgang giver vigtige oplysninger for at forstå samspillet mellem evt, og modtagerens celler. Mens i nogle tilfælde evt bindes til overfladen af celler, er nogle blærer hurtigt taget. Efter optagelsen levere evt deres ladninger til de celler, hvor de udøve deres lovgivningsmæssige funktioner.
Her, beskriver vi en protokol for at måle den barriere funktion i endothelial celler in vitro- af kvantificere overførsel af en fluorescerende dextran gennem en cellulære éncellelag. Mere følsomme røbestoffer kan bruges såsom radiolabeled markører. De kræver dog særlige forsigtighedsregler for brugen. Andre assays eksisterer for at måle den in vitro- barriere funktion som transendothelial elektrisk modstand (TEER), som måler tight junction integritet. Endelig visualisere ZO-1, et tight junction-protein, ved immunfluorescens tillader vurdering af stram vejkryds integritet som godt10. Da evt er kompleks og heterogen enheder indeholdende flere laster med potentielle lovgivningsmæssige egenskab, er det nyttigt at overexpress en bestemt RNA for at studere dens virkning på den modtagende celle. Derfor, vi også definere en protokol, der sigter mod at skabe stabil cellelinjer udtrykker miRNA interesse10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere parasitter, herunder Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania og Trichomonas udløser frigivelsen af evt af inficerede vært-cellen. Afhængigt af patogener, kan den frigivne EVs modulere immunrespons vært eller mægle cellulære kommunikation mellem parasitter6. Der er imidlertid lidt beviser tyder på, hvordan disse små blærer bidrage til malaria sygdom. Her har vi beskrevet flere måder at undersøge funktionen evt under Plasmodium infektion. For eksempel kan evt optagelse af modta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev økonomisk støttet delvis af Novartis grundlaget for medicinsk – og biologiske forskning (til PYMS), Gottfried og Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (til MW og PYMS) og forskning pulje af Fribourg Universitet (til PYMS). Yderligere tilskud omfatter den schweiziske regering Excellence stipendier til udenlandske forskere (til KAB og SM). Vi takker Isabelle Fellay og Solange Kharoubi Hess for teknisk support.
Materials
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher – Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
References
- WHO. . WHO Malaria Report 2015. , (2015).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
- Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
- Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
- Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
- Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
- Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
- Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
