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화학

Optimiser la constitution génétique de produit chimique sondes dans RCPG pour Photo-réticulation cartographie et de la chimie de Bioorthogonal dans les cellules de mammifères vivants

Published: April 09, 2018
doi:
10.3791/57069
, , ,
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences,University of Leipzig

Summary

Un test facile de fluorescence est présenté afin d’évaluer l’efficacité des paires d’amino-acyl-ARNt-synthétase/ARNt intégrant les amino-acides non canoniques (ANAC) protéines exprimées dans des cellules de mammifères. L’application de l’ANAC à étudier G-récepteurs couplés aux protéines (RCPG) est décrite, y compris la cartographie photo-réticulation de liaison de sites et bioorthogonal GPCR étiquettes apposées sur des cellules vivantes.

Abstract

La constitution génétique des acides aminés non canoniques (ANAC) via la suppression de codon stop ambre est une technique puissante pour installer des sondes artificiels et réactives moitiés sur protéines directement dans les cellules vivantes. Chaque ncAA est constituée par deux (RAA) orthogonal dédié suppresseur-/ amino-acyl-ARNt-synthétase de tRNA qui est importé dans l’organisme hôte. L’efficacité de l’incorporation de différents ANAC peut diffèrent grandement et insatisfaisante dans certains cas. Orthogonaux paires peuvent être améliorées en manipulant les RAA ou l’ARNt. Cependant, évolution dirigée des ARNt ou RAA à l’aide de grandes bibliothèques et les méthodes de sélection morts/vivants ne sont pas réalisables dans les cellules de mammifères. Est présenté ici, un essai basés sur la fluorescence facile et robuste pour évaluer l’efficacité des paires orthogonales en cellules mammifères. Le test permet de dépistage des dizaines ou des centaines de variantes de RAA/ARNt avec un effort modéré et dans un délai raisonnable. Utilisation de ce test pour générer de nouveaux ARNt qui améliorent considérablement l’efficacité du système orthogonal pyrrolysine est décrite, ainsi que l’application de l’ANAC à l’étude des protéines G récepteurs couplés (RCPG), qui contestent les objets de la ncAA mutagenèse. Tout d’abord, en intégrant systématiquement les une ncAA photo-réticulation tout au long de la surface extracellulaire d’un récepteur, les sites de liaison des ligands différents sur le récepteur intact sont mappés directement dans les cellules vivantes. Deuxième, incorpore un RCPG de dernière génération ANAC, ultrarapide récepteur sans catalyseur marquage avec un colorant fluorescent est démontrée, qui exploite bioorthogonal cycloaddition contrainte-favorisé inverse Diels Alder (SPIEDAC) sur les cellules vivantes. ANAC peut être généralement appliquée à n’importe quelle protéine indépendamment sur sa taille, la méthode est d’intérêt général pour un certain nombre d’applications. En outre, incorporation de ncAA ne nécessite pas d’aucun équipement spécial et est facilement effectuée dans les laboratoires de biochimie standard.

Introduction

L’incorporation génétique des sondes chimiques dans les protéines est une méthode puissante pour faciliter l’étude des aspects structurels et dynamiques de la fonction des protéines directement dans le contexte autochtone de la cellules vivantes. De nos jours, des centaines d’amino-acides non canoniques (ANAC) équipés de groupes chimiques plus disparates peuvent être relativement incorporés dans les protéines par biosynthèse1,2,3,4. Entre eux, on trouve photosensibles ANAC comme photo-agents réticulants5, mis en cage-photo6,7,8,9 et photo-commutable acides aminés10, 11, acides aminés portant tendues alcènes et alcynes pour bioorthogonal sans catalyseur chimie2,12,13,14,15,16 ,,17acides aminés transportant dansyl18, coumarine9,19et fluorophores21 prodan20,et acides aminés équipés d’autres sondes biophysiques comme Bien que le post traductionnelle modifications1,2,3,4,22,23,24,25.

Le codage génétique d’un ncAA est activé par un dédié amino-acyl–synthétase de tRNA (RAA) couplé à un suppresseur-tRNA apparenté, qui incorpore la ncAA en réponse à un codon stop ambre pendant la synthèse ribosomique ordinaire. paires de ncAARS/ARNt sont conçus afin d’être orthogonal dans l’organisme hôte, c’est-à-dire pas la diaphonie avec les paires endogènes. La technique est bien établie en hôtes procaryotes et eucaryotes et cellules facilement applicables aux mammifères. Paires pour l’incorporation de la ncAA en cellules mammifères reposent sur trois principaux systèmes orthogonaux : le système de tyrosyl, qui combine la TyrRS d’e. coli26 avec un suppresseur de tyrosyl ambre de b. stearothermophilus27 (Ec TyrRS / paire YamBst), l’e. coli leucyl système (EcLeuRS/ARNtLeuCUA paire)6,18,28 et le système de pyrrolysyl d’archaea (PylRS/ARNt Pyl paire)3, auquel cas l’ARNtPyl est un suppresseur de l’ambre naturel. En général, chaque ncAA est reconnu par un ncAARS spécialisées. Selon la structure de la ncAA, le ncAARS est obtenu par évolution dirigée de la TyrRS, LeuRS ou PylRS, bien que certains synthétases peuvent accepter plusieurs ncAA.

La paire orthogonale est importée dans les cellules en utilisant simplement un vecteur plasmidique. Plus efficaces et communes de plasmides sont bicistronique et codent pour la synthétase et l’ARNt formant la paire orthogonale29. Un deuxième plasmide codant pour la protéine d’intérêt portant un codon ambre sur le site désigné pour la modification est co-transfectée. La ncAA est simplement ajouté au milieu de croissance cellulaire. Cependant, différents groupes spécialisés utilisent souvent les différentes variantes de constructions de plasmide même pour l’incorporation de la ncAA même. Constructions diffèrent par l’arrangement des gènes dans le vecteur, le type de la synthétase, l’utilisation de codon dans le gène de la synthétase, l’utilisation de promoteur, la variante de l’ARNt et le nombre de cassettes d’expression ARNt. En outre, l’efficacité de l’incorporation de différents ANAC peut varier considérablement en raison de l’efficacité catalytique différente les synthétases différentes, la qualité de l’ARNt et autres facteurs30. Par conséquent, il est important de disposer d’une méthode rapide et fiable pour évaluer l’efficacité d’une paire orthogonale, à choisir le système le plus approprié pour une application souhaitée tant pour effectuer certaines étapes d’optimisation qui améliorent l’expression protéique globale rendements.

Nous avons établi une analyse axée sur la fluorescence simple et robuste pour évaluer l’efficacité des paires orthogonales29 (Figure 1). Dans l’essai, les cellules sont transfectées conjointement avec le plasmide codant pour la paire orthogonale, ainsi que d’un plasmide de journaliste bicistronique codant pour la protéine fluorescente verte portant un codon d’arrêt ambre à une position permissive (EGFPTAG) et la gène mCherry. Fluorescence rouge et verte de lysats de cellules entières sont interprétées dans des canaux séparés sur un lecteur dans une plaque à 96 puits. L’intensité de la fluorescence verte est directement en corrélation avec l’efficacité de la répression ambre, alors que l’intensité de la fluorescence rouge donne une estimation directe de la taille de l’échantillon mesuré et l’efficacité de transfection. En ce qui concerne des études similaires basées sur la fluorescence assistée cellule triant (FACS) lecture31,32, le test donne une évaluation immédiate et complète de l’expression protéique dans la population de cellules entières, ce qui est plus représentatives des conditions expérimentales usuelles et propose une acquisition de données plus facile et le traitement avec le logiciel standard. Dans l’ensemble, le principal avantage du dosage est qu’un support pour un grand nombre d’échantillons peut être analysé en parallèle. À l’aide de ce test, nous avons projeté une bibliothèque conçue rationnellement des ARNt-suppresseur pour améliorer l’efficacité du système orthogonal Pyl30. Cet ouvrage décrit le protocole expérimental pour effectuer ce test et montrent des exemples de son application, y compris l’optimisation de la paire orthogonale pour l’incorporation de la photo-réticulation ncAA p-azido-L-phénylalanine (Azi) et la comparaison des efficacité de l’incorporation de différents acides aminés (Figure 2).

Au cours des dernières années, outils de ncAA sont sont avérées très puissants pour étudier la structure et les aspects fonctionnels de la G-protéine couplée récepteurs (RCPG)33,34,35,,du3637 , 38. chez les humains, les RCPG forment une grande famille de récepteurs membranaires (800 membres) et représentent les principales cibles des médicaments thérapeutiques. Il est toujours difficile de directe caractérisation structurale des RCPG et méthodes biochimiques complémentaires sont très nécessaires pour leur enquête. Nous avons mis au point l’utilisation de photo-réticulation ANAC pour cartographier les surfaces GPCR et découvrez le ligand liant poches34. Est-ce que nous en utilisant notre système optimisé pour l’incorporation de l’Azi, systématiquement intégrées Azi dans tout le domaine de juxtamembrane entier d’un RCPG directement dans les cellules de mammifères vivants. Lors de l’irradiation UV, Azi forme une espèce de nitrène fortement réactif qui capte par covalence molécules voisines. Quand le ligand est ajouté au système, Azi sert une sonde de proximité à révéler quels postes du récepteur se rapprochent du ligand lié. De cette façon, le mode de liaison de l’hormone de neuropeptide urocortine I (Ucn1) sur le récepteur de la classe B GPCR corticotropin-releasing-factor de type 1 (CRF1R)33 a d’abord été dévoilé. Dernièrement, nous avons divulgué modes de liaison distincte des agonistes et antagonistes sur les mêmes récepteurs38. Une approche similaire a été appliquée par les autres pour révéler des orthosteric et des sites de liaison allostérique d’autres peptides et des ligands de petites molécules autres RCPG39,40,41,42. Ce manuscrit décrit le protocole expérimental appliqué dans notre laboratoire photo-réticulation cartographie des surfaces des RCPG. La méthode est relativement rapide, simple et ne nécessite pas d’aucun équipement spécial, afin qu’elle s’applique dans les laboratoires de biochimie standard. Ce qui est important, l’approche fournit un outil précieux non seulement pour identifier les sites de liaison de ligand où les données structurales 3D sont rares, mais aussi pour compléter les données in vitro existantes avec les informations de récepteurs entièrement post-traductionnellement modifiées dans le environnement physiologique de la cellule en direct.

Le développement récent de nouveaux ANAC portant sur les côté chaîne des groupes chimiques convenant ultra-rapide sans catalyseur bioorthogonal chimie a ouvert la possibilité d’installer des fluorophores de dernière génération pour l’imagerie de Super-résolution en protéines directement sur la vie des cellules de2,43. Ces ancrages chimiques comprennent tendue cyclooctyne SCOK14, nonyne bicyclo [6.1.0] BCNK12,17et trans-cyclooctènes de TCO * K13,15,17 entre autres ANAC héberger un norbornène16,17,44 ou le cyclopropène45,46 portion. ANAC encombrants pour la chimie de bioorthogonal est intégrées par une variante de le PylRS généralement décrit comme PylRSAF (indiquant la mutation Y271A et Y349F en PylRS de M. barkeri ), ainsi que par d’autres ad hoc a évolué de ncAARSs17 , 44. les ancres bioorthogonal réagissent avec tetrazine réactifs47 par cycloaddition de Diels-Alder inverse électron-demande pour donner des rendements élevés et étiquetage dans quelques minutes43,48. Cependant, application de cette approche puissante pour étiquette RCPG a été difficile en raison d’une faible efficacité globale du système orthogonal ncAA incorporation. En utilisant notre système amélioré de Pyl, nous avons récemment démontré incorporation de haut rendement de ces acides aminés dans les RCPG et ultrarapide GPCR étiquetage sur la surface des cellules de mammifères vivants30. Récepteurs marqués étaient encore fonctionnels, car ils physiologiquement intériorisé dès l’activation du récepteur avec un agoniste. Le protocole expérimental pour l’incorporation de bioorthogonal ancres dans les RCPG et les étapes suivantes d’étiquetage sont décrites ici. Équiper les RCPG avec des fluorophores lumineux petits est la première étape fondamentale vers l’étude de la dynamique des structures RCPG dans les cellules vivantes par l’intermédiaire de techniques de microscopie avancées.

Protocol

1. fluorescence-based Screening des efficacités d’Incorporation (Figure 1) Maintenir les cellules HEK293 dans le milieu de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM ; taux de glycémie élevé, 4 mM de glutamine, pyruvate) additionné de 10 % (v/v) sérum fœtal (SVF), 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine à 37 ° C, humidité de 95 % et 5 % de CO2. Les cellules des graines la veille de la transfection. Détacher les cellules…

Representative Results

Les grandes lignes de l’essai de fluorescence sont représenté dans la Figure 1. Le dosage est utilisé dans trois applications. En premier lieu, un certain nombre de variantes de l’ARNt pour incorporation de Lys(Boc) par la paire orthogonale Pyl est examiné. Lys(BOC) est un acide aminé stériquement semblable à Pyl. Pyl n’étant pas disponible dans le commerce, Lys(Boc) est couramment utilisé comme substrat standard pour la PylRS. Les ARNt filtré…

Discussion

Le protocole décrit une analyse simple et fiable pour évaluer l’efficacité des paires orthogonales pour l’incorporation de l’ANAC protéines exprimées dans des cellules de mammifères. Le principal avantage de cette méthode en ce qui concerne les tests couramment issu des FACS est qu’il permet la préparation simultanée et la mesure d’un plus grand nombre d’échantillons et fournit des données qui sont analysées facilement à l’aide d’un logiciel ordinaire. La disponibilité d’une méthode de d?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été fondé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) au titre de subventions CO822/2-1 (programme Emmy Noether) et CO822/3-1 à c. i.

Materials

Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal [Turnbull]
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal [Turnbull]
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References

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38 (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7 (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126 (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132 (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136 (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128 (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13 (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4 (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128 (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13 (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136 (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301 (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. , (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464 (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117 (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7 (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292 (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289 (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10 (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32 (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49 (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62 (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5 (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. 생화학. 50 (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19 (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2 (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531 (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531 (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. 화학. 22 (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

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Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).
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