Laboratoriet bostäder av turkos killifish kan skalas upp till huset och effektivt höja tusentals enskilda fiskar i ett centraliserat vattenfiltreringssystem, anställa den samma infrastruktur som används för standard zebrafiskar faciliteter. Här detalj vi en lista över standardiserade förfaranden som tillåter effektiv killifish underhåll.
Utvecklingen av djurhållningspraxis i icke-modell laboratorium fisk som används för försöksändamål har vunnit stort från etableringen av referens fisk modellsystem, såsom zebrafisk och medaka. Under de senaste åren, har en framväxande fisk – den turkosa killifish (Nothobranchius furzeri) – antagits av ett växande antal forskargrupper inom biologi av åldrande och ekologi. Med en fångenskap livslängd på 4-8 månader, denna art är den shortest-lived ryggradsdjur upp i fångenskap och tillåter forskarsamhället att test – på kort tid – experimentell interventioner som kan leda till förändringar av den åldrande och livslängd. Ges unika biologi av denna art, kännetecknas av embryonala diapause, märkt explosiva sexuell mognad, morfologiska och beteendemässiga könsdimorfism- och deras relativt kort vuxen livslängd – ad hoc- djurhållning praxis är brådskande efterfrågan. Detta protokoll rapporterar en uppsättning viktiga djurhållning åtgärder som tillåter optimal turkos killifish laboratorium vård, aktivera forskarsamhället att anta denna art som en kraftfull laboratorium djurmodell.
Med tanke på deras kort livslängd och snabba livscykel, är turkos killifish snabbt växande som lovande nya modellorganism i biologi1,2,3. Arten kännetecknas av en unik livscykel för en benfisk, bestående av embryonala diapause, snabb pubertetsutveckling och en utökad post-reproductive liv steg4,5. Senaste arbete har bidragit till att belysa biologin av denna art både i fångenskap och i vilda6,7. Turkos killifiskar lever i säsongens färska vattenförekomster som bildar under regnperioden i den afrikanska savannen i Zimbabwe och Moçambique. Under den torra säsongen överleva embryon i torra leran i avsaknad av vatten enligt en stress-resistant levnadsstadier som kallas diapause.
Genetiska kartor för denna art har varit genererade8,9, och nyligen sin arvsmassa har sekvenserade och monteras10,11. Flera inavlade laboratorium fisk stammar har utvecklats, och genmodifiering och arvsmassan redigering via CRISPR/Cas9 har blivit tillgängliga i denna art, de facto främja turkos äggläggande tandkarpar som konkurrenskraftiga laboratorium ryggradsdjur modellorganism 12,13,14.
Även om ett laboratorium protokoll har redan publicerats för denna art15, i detta protokoll utvecklar vi en omfattande lista över experimentell laboratorium riktlinjer som särskilt syftar till studier som undersöker åldrande och överlevnad. Detta protokoll kan forskare redan bekant med zebrafiskar och medaka djurhållning att bli insatt i turkos killifish djurhållning genom att anta ett minsta antal viktiga justeringar. På samma gång ger det här protokollet forskare utan tidigare erfarenhet i fisk djurhållning med nödvändiga verktyg för att höja en blomstrande turkos killifish koloni.
Vi beskriver ett protokoll för laboratoriet odling av turkos killifish, inklusive embryosamlingen, inkubation, samt vuxna fiskar bostäder, avel och utfodring. Våra protokoll är specifikt riktad till laboratorier som bedriver forskning som fokuserar på vuxna fiskar, särskilt för experimentella studier på åldrande och livslängd. Turkos killifish kan höjas på en standard zebrafiskar anläggning; viktiga aspekter av killifish djurhållning skiljer sig dock från standard zebrafiskar vård16. Dessa justeringar innefattar tidig övergång från en Artemia enda kost till en kost kompletteras med proteinrika blod mask, liksom specifika steg i embryo inkubation, bestående av en flytande och torra inkubation scenen.
Kritiska steg inom protokollet omfatta frakt embryon inom 8-30 ° C temperaturområde. Vid avel beror fruktsamhet på utfodring frekvens och livsmedelskvalitet; Därför rekommenderar vi minst två utfodringar per formeringen tank för att höja embryon avkastning (se avsnitt 5.6) dag. Under embryo blekning, omfatta inte embryot inkubation i blekning lösningen. Detta kan orsaka skador på ägg chorion och ökad embryo dödlighet. När ruvning embryon med metylenblått, inte att förlänga inkubation av redo-till-lucka embryon längre än 2 veckor som deras bärkraft minskar dramatiskt. För kläckning turkos killifish, låg temperatur av humus acid lösning förbättrar kläckning och fullständig nedsänkning av embryon i lösningen tillåter synkroniserad kläckning. Inte tillräcklig luftning under inkubation resultaten i höga andelen stek inte kunna fylla gas urinblåsan (”belly-reglaget” fenotyp, se kommentarer i avsnitt 5.1).
Begränsning av protokollet för avel inkluderar användning av sand substrat som utgör utmaningar för centraliserad filtreringssystem och bör ersättas med alternativa metoder i framtiden. Möjliga alternativ kunde vara att använda zebrafiskar avel tankar. Embryo blekning kan orsaka stora fysikalisk-kemiska förändringar i ägg chorion som kan leda till förändrad chorion fysiologi och kläckning framgång. Konstant exponering av embryon för metylenblått kan medföra långsiktiga förändringar hos vuxna fiskar fysiologi. Att höja vuxen fisk i individuella tankar för överlevnad kohortstudier kan negativt påverka fisk beteende och hälsa. Gruppboende för överlevnad kohortstudier lägger dock betydande störfaktorer på grund av inrättandet av social dominans och manliga territorier, vilket leder till stränga sociala hierarkier. Vi bedömer därför att isolering av manliga fisk för överlevnad studier är en rimlig kompromiss. Utfodring laboratorium killifish kolonier med levande föda från FN-kontrollerade källor lägga till en risk för externa föroreningar från parasiter och potentiellt patogena mikrobiella samhällen. I framtiden, bör en ad hoc-sterila fiskfoder utarbetas.
Framtida förbättringar av detta protokoll kommer att fokusera på en kontrollerad, icke-levande diet, som fortfarande leder till att slutföra sexuell mognad inom 3-4 veckor. Sammanfattningsvis erbjuder våra protokoll tillgänglighet till turkos killifish laboratorium odling till en bred vetenskaplig gemenskap.
The authors have nothing to disclose.
Vi tacka Alessandro Cellerino, Tyrone Genade, Anne Brunet, Sabrina Sharp, Mickie Powell, Simone Keil, Yumi Kim, Patrick Smith, Kai Mathar och alla medlemmar av Valenzano labbet vid Max Planck-institutet för biologi för åldrande för att bidra till olika aspekter av det nuvarande killifish djurhållning protokollet under åren.
Probe calibration buffer solution pH=7.0 | Roth | A518.1 | 1L buffer solution pH=7.0 to calibrate water system pH-electrode |
Probe calibration buffer solution pH=4.0 | Roth | P712.1 | 1L buffer solution pH=4.0 to calibrate water system pH-electrode |
Conductivity standard | VWR | 83607.260 | 500 mL Conductivity standard 1,413 uS/cm to calibrate water system conductivity-electrode |
Easy Strips Test 6in1 | JBL | 2533900 | Test strips for determination chlorine values of system water |
Ammonia Test | JBL | 2536500 | Test to determine ammonia content of system water |
Red Sea Salt | Red Sea | 22 kg bucket | |
Sodium hydrogen carbonate | VWR | 27780.360 | |
Humic acid | Sigma- Aldrich | 53680-50G | |
New HUFA Artemia enrichment | ZM Systems UK | 75g bottle | |
Methylene blue | Roth | AE64.1 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma- Aldrich | 31642-1L | 30% (w/w) |
Cononut fiber | Dragon | ZCS010 | |
Whatman paper | GE healthcare | 3030-690 | |
Ethanol pure | VWR | 20821.467 | 100% |
Silica sand | local pet shop | ||
Artemia Eggs Premium Grade | Sanders | ||
Bloodworm | local distributor | Poseidon Aquakultur Germany | |
dNTPs solution mix | Biolabs | N04472 | 10mM |
Taq DNA polymerase | Invitrogen | 18038-042 | 5U/uL |
PCR 10x Buffer | Invitrogen | 18038-042 | |
MgCl2 | Invitrogen | 18038-042 | 50mM |
NaOH | Sigma- Aldrich | S8045-500g | 50mM |
Tris-HCl, pH=8.0 solution | Sigma- Aldrich | T2694-1L | 1M |
HCl 37% | Sigma- Aldrich | H1758-500mL | |
Aquatic housing system | Aquaneering | Central filtration equipped aquatic system | |
Fish tanks | Aquaneering | volume: 0.8L, 2.8L, 9.5L; equipped with baffles, fry mesh and lids | |
Orbital shaker | VWR | 89032-100 | model 5000 |
Microbiological incubator | Thermo Scientific, Heratherm | 50125882 | model IMC18; for storage embryos in the liquid phase, set to t=27-28°C |
Cooling Incubator | Binder | 9020-0209 | model KT115; for storage embryos in the solid phase, set to t=27-28°C |
Hatching incubator | Thermo Scientific, Heratherm | 51028114 | model OGS180; for embryos hatching, set to t=27-28°C |
Stereomicroscope | Leica | model M80 | |
Breeding sand/hatching boxes | Roth | 1598.1 | 1000mL |
Petri dish | Sarstedt | 82.1473 | 92x16mm |
50mL Conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
15mL Conical tube | Sarstedt | 62.554.002 | |
Disposable Plastic Pasteur pipette | Roth | EA71.1 | 2mL; For fish feeding with bloodworms, or embryos selection cut off the tip to open 3-4mm diameter |
Serological pipette | Sarstedt | 86.1689.001 | 50mL |
Syringe | Henke Sass Wolf | 4100-000V0 | 10mL |
Metal strainer | fineness <1mm; for embryos collection | ||
Tweezers | Dumont | 0508-5/45-PO | type5/45; for embryos transfer |
25L Brine shrimps hatcher | Aquaneering | ZHBS25 | main hatcher |
500mL Brine shrimps hatcher | JBL | 6106100 | model Artemio 1; backuo hatcher |
Narrow-mesh fish nets | JBL | ||
Sand beaker | VWR | BURK7102-5000 | 5000mL |
Brine shrimps separation beaker | VWR | BURK7102-2000 | 2000mL |
Plastic zipper bag | Roth | P279.2 | for dead fish storage |
Pipetboy | Integra | 155000 | model Pipetboy acu2 |
Parafilm | P-Lab | P701605 | |
Air tubing | www.zajac.de | AQ380 | 4-6 mm diameter |
1L Glass bottle | VWR | 215-1595 | |
2L Glass bottle | VWR | 215-1596 | |
500mL Squeeze bottle | Roth | K665.1 | for fish feeding with brine shrimps |
120 micron brine shrimps strainer | Florida Aqua Farms | BB-PC2 | for brine shrimps/bloodworm collection |
Finish filter socks | Aquaneering | MFVB025C | 25 micron |
Central filtration fish housing system | Aquaneering, Techniplast, Aquatic Habitats, Aqua Schwarz |