미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

Summary

이 메서드는 3 차원 (3D) 모델 곤충 세포로 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 보여 줍니다. 초파리 애벌레에서 hemocytes 바이러스 성 또는 세균성 병원 체, ex vivo 또는 vivo에서감염 되었습니다. 감염 된 hemocytes 다음 고정 되었고 confocal 현미경 및 후속 3D 셀룰러 재건 이미징 스테인드.

Abstract

초파리 melanogaster 의 병원 성 감염 시 hemocytes 감염을 통해 면역 반응에 중요 한 역할을 재생합니다. 따라서,이 프로토콜의 목표, 즉 hemocytes의 특정 면역에 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 개발 하는 것입니다. 여기, 3 × 10에 제시 된 방법을 사용 하 여⁶ 라이브 hemocytes ex vivo 감염에 대 일 분에서 200 초파리 3^rd 탈피 애벌레에서 얻을 수 있습니다. 또는, hemocytes는 감염 된 vivo에서 구명 hemocyte 추출에 의해 감염 된 후 24 시간에 3^rd 탈피 애벌레의 주사를 통해 하실 수 있습니다. 이러한 감염된 1 차 셀 고정, 스테인드, 고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. 그럼, 3D 표현 병원 체 침입을 결정적으로 보여 이미지에서 생성 되었습니다. 또한, qRT-PCR에 대 한 높은-품질 RNA 병원 체 mRNA 다음의 탐지를 위해 얻어질 수 있다 감염, 그리고 충분 한 단백질 서쪽 오 점 분석에 대 한 이러한 셀에서 추출할 수 있습니다. 함께 찍은, 우리 병원 체 침입의 확실 한 조정 및 세균성과 바이러스 성 병원 체 종류와 hemocyte 추출 위한 효율적인 방법 초파리 에서 충분 한 라이브 hemocytes를 사용 하 여 감염의 확인 하는 방법 제시 vivo ex vivo에서 감염 실험의 애벌레

Introduction

초파리 melanogaster 타고 난 면제¹의 연구에 대 한 기초가 튼튼한 모델 생물 이다. 타고 난 면역 반응 동안 hemocytes 병원 체 도전 하 응답에서 중요 한 역할을 재생합니다. Hemocytes는 캡슐화 기생충, 곰 팡이, 바이러스, 그리고 세균성 감염^2,3중 phagocytic 행동을 통해 병원 체 퇴치에 중요 한 기능을가지고 위한 중요 합니다.

최고의 호스트의 병원 성 미생물 감염에 타고 난 면역 반응 이해, 그것은 병원 체 감염 시 호스트 셀을 침공 하는 방법을 시각화 하는 것이 중요. 이 시각화의 메커니즘의 이해에 기여 한다. 병원 체 세포내 지역화의 세부 사항 및 세포질 응답, 이러한 데이터는 감염 하는 미생물이 작용 하는 세포 세포 호스트 응답에 대 한 단서를 제공할 수 있습니다. 따라서, 영상 현미경 검사 법에 의해 후 3D 모델 재구성 호스트 세포에 병원 균의 정확한 위치를 확인 하려면 유용할 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 Coxiella burnetii (C. burnetii), Q 열, 기본 초파리 hemocytes에 둘 다 인간과 동물 건강에 심각한 위협이 포즈 동물 매개 질병의 원인이 되는 대리인의 침공 시각. 최근에, 그것은 초파리 는 Biosafety 수준 2 9 마일 단계 II (NMII) 복제 4 C. burnetii 의 긴장과이 긴장은 초파리⁴를 복제할 수는 를 나타내는에 취약 입증 되었다 초파리 C. burnetii 병 인을 공부 하는 모델 생물으로 사용할 수 있습니다.

이전 연구는 호스트의 타고 난 면역 반응 검사를 hemocytes를 사용 했습니다. Hemocytes 형태학 관찰^5,,67, 형태학 분석^2,8, 먹어서 분석^2,3, qRT-PCR² 사용 되었습니다. ^{, 9}, immunoprecipitation^10,11, immunofluorescent 분석^10,12, immunostaining¹³, immunoblotting^{3,10, 11} 및 immunohistochemistry^9,14. 초파리 S2 세포, 다양 한 생체 외에서 실험에 사용할 수도 있지만 immortalization 및 잠재적인 기존의 바이러스 감염 그들의 행동^15,16변경. S2 세포 같은 불멸 하 게 셀 라인, 반대로 1 차 셀의 사용 수 있습니다 타고 난 면역 기능 연구에 대 한 시스템에서 전체 유기 체의 더 대표. 또한, hemocytes에서 vivo에서, 추출, 이전 감염 다른 호스트 단백질 및 조직, 비보 전 감염 전에 hemocytes의 추출에 비해 우위를 셀 수 있습니다. 다른 방법의 수는 hemocytes 살아^8,17,,1819계속 시간의 짧은 기간에 hemocytes의 충분 한 수를 이용 되어 있다.

이 연구에서는 hemocytes C. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria), 또는 무척추동물 무지개 빛깔의 병원 성 미생물 감염에 대 한 초파리 3^rd 탈피 애벌레에서 추출 하는 방법 소개 6 (IIV6) 바이러스입니다. Vivo에서 및 비보 전 hemocyte 감염에 대 한 방법을 설명합니다. Vivo에서-와 ex vivo-감염된 hemocytes confocal 현미경 검사 법으로 구상 되었고 C. burnetii 의 3D 모델을 구축 하는 데 사용. 또한, 프로토콜을 사용 하는 추출, ex vivo-감염된 hemocytes 유전자와 단백질 식에 사용 된 분석 실험. 특히, IIV6 및 Listeria감염의 정도 검사, 총 RNA 또는 단백질 했다 격리 qRT-PCR 또는 서쪽 오 점 분석에 대 한 셀에서. 함께 찍은, 프로토콜 빠르게 3^rd 탈피 애벌레와 기본 hemocytes, vivo에서 또는 전 비보감염 증거에서 hemocytes의 높은 숫자를 수집 하는 메서드를 제공 합니다에 대 한 적합 한 플랫폼 미생물 병원 체 감염 연구 그리고 현미경 검사 법, transcriptomics, proteomics 등 해당 다운스트림 분석.

Protocol

1. 감염 비보 전 매체 및 장비 무 균 조건 하에서 준비 신선한 초파리 Hemocyte 분리 매체 (작성자) 75% 슈나이더의 초파리 를 포함 보통 25%로 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 필터 살 균 그것. 레이어는 stereomicroscope에서 10 cm x 10 cm 파라핀 영화의 2-3 조각. 유리 모 세관을 준비 합니다. 최대의 55%를 모 세관 끌어당기는 히터를 설정 합니다. 약 10 µ m의 날카로운…

Representative Results

수집 3 × 10에 ex vivo 감염에 대 한 hemocytes 살고6 hemocytes 200 초파리 3rd 탈피 애벌레에서 추출 되었다. 우리의 방법 개발, 다양 한 다른 기술 시도 했다. 개별 애벌레 해 부까지 1.5 h 걸릴 것 이라고 하 고 ~ 8000 셀의 평균이 방법18, 대부분의 컬렉션의 끝에 의해 살아 있던을 사용 하 여 얻은 했다. 다음, 우리는 hemocytes를 포함 하는 h…

Discussion

잘 이해 하려면 어떻게 호스트 세포 감염 될, 이전 안 된 병원 체와 세포 유형 조합⁴에 실험 하는 경우에 특히 셀, 병원 체의 지역화를 명확 하 게 중요 하다. 동안 감염에 따라 세포질 응답 캐스케이드 공부 생산 병원 체 침입을 나타낼 수 있습니다, 이미징 및 세포 응답 데이터의 조합 병원 체 침입 및 감염을 필수적 이다. 호스트 세포에 병원 체의 2 차원 이미지를 보여 주는 보고?…

Materials

Schneider's Drosophila Medium	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	21720024	1.1.1), 2.1.2)
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences  (HyClone)	SH30070.03HI	1.1.1), 2.1.2)
Filter (0.22 µL)	RESTEK	26158	1.1.1)
Strainer (100 µm)	Greiner bio-one	542000	1.2.1), 2)
Stereo microscope	Amscope	SM-1BSZ-L6W	1.2), 2)
Glass capillary	Fisher Scientific	21-171-4	1.1), 1.2), 2)
Capillary puller	Narishige International USA, Inc.	PC-10	1.1.3)
Mineral oil	Snow River Products		1.1.4)
Nanoinjector	Drummond Scientific Company	3-000-204	1.1), 1.2), 2.2)
Forceps	VWR	82027-402	1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 delivery apparatus	Genesee Scientific	59-122BC	1.2), 2)
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15250061	1.3)
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100	1.3)
24 well plate	Greiner bio-one	662160	1.4), 2.2)
Coxiella burnetii – mCherry	Dr. Heinzen, R.		1.4), 2.2)
Drosophila fruit juice plates	Cold Spring Harbor Protocols		2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
Agar	Fisher Bioreagents	BP1423-500	2.1.1.1)
Methyl paraben	Amresco	0572-500G	2.1.1.2)
Absolute ethanol	Fisher Bioreagents	BP2818-500	2.1.1.2)
Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL	Amazon	B0025UJVGM	2.1.1.3)
Petri dishes, 10 x 35 mm	Fisher Scientific	08-757-100A	2.1.1.4)
Microscope cover glass	Fisher Scientific	12-545-80	1.4.4), 2.2.2)
Yeast, Bakers Dried Active	MP Biomedicals	0210140001	2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)
Tungsten needle	Fine Science Tools	10130-20	2.1)
Holding forceps	VWR	HS8313	2.1)
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	FLO4042-500	3.1.3)
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500	3.1.3)
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP9706-100	3.1.3)
4',6-diamidino-2-phenylindole	Thermo Fisher Scientific	62247	3.1.4)
Antifade mounting medium	Thermo Fisher Scientific	P36930	3.1.6)
Confocal microsope	Leica	TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope	3.2)
3D imaging reconstruction software	Leica	LASX with 3D visualization module	3.3)
Microscope slides	Fisher Scientific	12-552-3	3.1.6)
Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6)	Dr. Teixeria, L.		4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenes	ATCC	strain: 10403S	4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C.
DNase I	Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)	18068015	gDNA degradation
cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708891	cDNA synthesis
IIV6_193R_F	IDT		qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'
IIV6_193R_R	IDT		qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'
RpII_qRTPCR_fwd	SIGMA-ALDRICH		qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
RpII_qRTPCR_rev	SIGMA-ALDRICH		qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR reagent	Thermo Fisher Scientific	K0251, K0252, K0253	qRT-PCR
Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4351107, 7500 Software v2.0	qRT-PCR
Anti-Listeria monocytogenes antibody	abcam	ab35132	Western blot
Anti-Actin antibody produced in rabbit	SIGMA-ALDRICH	A2066	Western blot
Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate	Promega	W4011	Western blot