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생화학

Procédé de repliement efficace et la Purification des chémorécepteurs Ligand Binding Domain

Published: December 12, 2017
doi:
10.3791/57092
,
1Infection and Immunity Program,Monash Biomedicine Discovery Institute, 2Department of Microbiology,Monash University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology,Monash University

Summary

Une procédure est présentée pour le repliement de la domaine de liaison du ligand périplasmique dCACHE de Campylobacter jejuni zone chémoréceptrice Tlp3 de corps d’inclusion et de la purification pour produire des quantités de milligramme de protéine.

Abstract

Identification des ligands naturels des chémorécepteurs et études structurelles visant à élucider les bases moléculaires de la spécificité de ligand peut être grandement facilitée par la production de quantités de milligramme de domaines de liaison du ligand pur, plié. Tentatives de façon hétérologue express domaines de liaison du ligand périplasmique de chémorécepteurs bactériennes Escherichia coli (Escherichia coli) souvent entraîner leur ciblage dans les corps d’inclusion. Ici, on présente une méthode pour la récupération de la protéine de corps d’inclusion, son repliement et la purification, le domaine de liaison du ligand dCACHE périplasmique de Campylobacter jejuni (c. jejuni) zone chémoréceptrice Tlp3 en prenant comme exemple. L’approche implique l’expression de la protéine d’intérêt avec un CLIVABLES son6-tag, l’isolement et induite par l’urée solubilisation des corps d’inclusion, protéine de repliement de l’appauvrissement de l’urée et de purification par chromatographie d’affinité, suivi par chromatographie d’enlèvement et d’exclusion stérique tag. La spectroscopie de dichroïsme circulaire est utilisée pour confirmer l’état plié de la protéine pure. Il a été démontré que ce protocole est généralement utile pour la production de quantités de milligramme de domaines de liaison du ligand périplasmique dCACHE des autres chémorécepteurs bactériennes sous forme soluble et cristallisable.

Introduction

Le chimiotactisme et la motilité ont démontré que jouent un rôle important dans la pathogenèse de Campylobacter jejuni en favorisant la colonisation bactérienne et l’invasion de l’hôte1,2,3. Chimiotaxie permet aux bactéries de s’orienter vers un environnement optimal pour la croissance, que guidés par des signaux chimiques. Ce processus implique la reconnaissance de signaux chimiques intracellulaires et de l’environnement par un ensemble de protéines appelées chémorécepteurs, ou protéines de type transducteur (PLT). La plupart des chémorécepteurs sont des protéines membranaires incorporées avec un ligand extracytoplasmique contraignant (LBD), un domaine transmembranaire et un domaine cytoplasmique de signalisation, laquelle interagit avec les protéines de signalisation cytosoliques qui transmettent le signal pour les moteurs flagellaires4,5,6,7.

Onze des chémorécepteurs différentes ont été identifiées le génome de c. jejuni 4,8. À ce jour, seuls certains de ces chémorécepteurs ont été caractérisées et la spécificité de ligand de Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712et13 de la Tlp11 est connue. Identification des ligands naturels les chimiorécepteurs restants chez cette espèce, et nombreux chémorécepteurs chez d’autres bactéries, peut être grandement facilitée par la production de la zone chémoréceptrice recombinant plissée et très pure LBDs14, 15 , 16. Toutefois, tentatives de façon hétérologue express périplasmiques LBDs des chémorécepteurs bactériennes Escherichia coli souvent entraîner leur ciblage en inclusions17,18,19 . Néanmoins, ce phénomène peut faciliter isolement facile et récupération de la protéine dans la main. Ici, on présente une méthode pour la récupération des protéines du corps d’inclusion, son repliement et la purification, à l’aide de la LBD périplasmique de la zone chémoréceptrice de c. jejuni Tlp3 à titre d’exemple. Cet exemple a été choisi car Tlp3-LBD appartient à la famille dCACHE20 de télédétection des domaines que l’on retrouve abondamment dans deux composants histidine kinases et de chémorécepteurs dans prokaryotes20,21, 22 , 23.

Dans cette approche, la construction de l’expression, basée sur un vecteur pET151/D-TOPO, a été conçue pour incorporer un N-terminal son6-tag suivie d’un tabac etch site de clivage de protéase de virus (TEV), pour tag ultérieures enlèvement19. Le protocole décrit la surexpression de la protéine dans e. coli, l’isolement et induite par l’urée solubilisation des corps d’inclusion et protéine de repliement de l’appauvrissement de l’urée. Suite de repliement, l’échantillon est purifié par chromatographie d’affinité, avec chromatographie d’enlèvement et d’exclusion stérique balise facultative. L’état plié de la protéine purifiée est confirmé en utilisant la spectroscopie de dichroïsme circulaire. Il s’agit d’une version modifiée de la méthode qui a été développée pour récupérer et épurer le LBD d’une autre zone chémoréceptrice, Helicobacter pylori TlpC19. Cette procédure, résumée dans la Figure 1, donne 10-20 mg de pure, non balisé Tlp3-LBD par 1 L de culture bactérienne, d’une pureté de la protéine de > 90 % estimé par SDS-PAGE.

Protocol

1. l’expression de son6-Tlp3-LBD chez e. coli Inoculer 150 mL de bouillon Luria-Bertani (LB) stérile contenant 50 µg, ampicilline des-1 mL avec BL21-Codon-Plus (DE3) – cellules RIPL transformées avec le vecteur pET151/D-TOPO pour l’expression de son6- Tlp3-LBD (résidus d’acides aminés 42-291), et Incubez il à 37 ° C dans un agitateur (diamètre de l’orbite, 25 mm) avec 200 tr/min pendant la nuit. Préparer six flacons Erlenmeyer de 2 L contenant…

Representative Results

Recombinante expression de son6-Tlp3-LBD chez e. coli a abouti au dépôt de protéines dans le corps d’inclusion. L’expression de 1 L de culture bactérienne calculée à l’étape 2.13 représentait environ 100 mg de son6-Tlp3-LBD déposé au corps d’inclusion. La technique d’isolation de protéine, décrit ici et illustré dans la Figure 1, se compose de la solubilisation des corps d’inclusion, le repliement des pr…

Discussion

Une procédure simple pour l’expression et le repliement de corps d’inclusion de la LBD périplasmique de la zone chémoréceptrice bactérienne Tlp3 est présentée. Préparation de la protéine pure implique la surexpression du gène codées en pET-plasmide dans e. coli, de purification et de solubilisation des corps d’inclusion, repliement de la protéine dénaturée et sa purification par l’affinité consécutive et étapes de la chromatographie d’exclusion stérique. L’urée-facilité de dénatu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Yu C. Liu pour ses premiers travaux sur la production Tlp3-LBD. Mayra A. Machuca est redevable à Admistrativo-Departamento de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS pour une bourse de doctorat.

Materials

Tris base AMRESCO 497
Sodium chloride (NaCl) MERK MILLIPORE 1064041000
Ampicillin G-BIOSCIENCES A051-B
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)  MERCK 52332
Triton x-100 AMRESCO 694
Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD AST0487
Urea AMRESCO VWRC0568
Dithiothreitol ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD C-1029
L-arginine monohydrochloride SIGMA-ALDRICH A5131
Reduced L-glutathione SIGMA-ALDRICH G4251
Oxidized L-glutathione SIGMA-ALDRICH G4376
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) SIGMA-ALDRICH  7558-79-4
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) SIGMA-ALDRICH 10049-21-5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) AMRESCO VWRC20302.260
Imidazole SIGMA-ALDRICH I2399
Glycerol ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD BIOGB0232
Nickel chloride (NiCl2) SIGMA-ALDRICH 339350
Glycine AMRESCO VWRC0167
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA-ALDRICH L4509
Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) NEW ENGLAND BIOLABS P7703
Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) MERCK UFC901096
50 mL Falcon tube FALCON BDAA352070
Dialysis tubing LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY Dialysis
Snakeskin dialysis tubing THERMO SCIENTIFIC™ 68100
Prepacked HiTrap Chelating HP column GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 17-0408-01 
EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser AVESTIN EmulsiFlex™ – C5
Peristaltic Pump P-1 GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 18-1110-91 
Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column  GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 28989336
JASCO J-815 spectropolarimeter JASCO J-815
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Keywords: ChemoreceptorLigand Binding DomainRefoldingPurificationInclusion BodiesE. ColiProtein ExpressionIPTG InductionCell LysisHomogenizationCentrifugationSDS-PAGEBuffer ExchangeSolubilizationProtein Purification
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Machuca, M. A., Roujeinikova, A. Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain. J. Vis. Exp. (130), e57092, doi:10.3791/57092 (2017).
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