גישה דו-שלבית לחקור ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של היווצרות האיברים במודל העופות: בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס Organogenesis הפרדיגמה
Summary
מאמר זה מספק גישה מעודכן למערכת כמירה שליו-עוף קלאסית ללמוד היווצרות האיברים, על ידי שילוב של הרומן במבחנה , ב ovo בצרות.
Abstract
העובר העופות, כמודל ניסויי, היה בעל חשיבות עליונה עבור תגליות שורשיות בביולוגיה התפתחותית. בין מספר גישות, היווצרות של תרנגולת-שליו כימרות ושימוש של קרום chorioallantoic (CAM) כדי לקיים את ההתפתחות של רקמות חוץ רחמי תאריך חזרה המאה הקודמת. כיום, השילוב של טכניקות אלה קלאסית עם מתודולוגיות במבחנה האחרונות מציע פרוספקטים הרומן לחקור לעומק את היווצרות האיברים.
כאן נתאר גישה דו-שלבית ללמוד ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של organogenesis. בקצרה, האזור עובריים המכיל את השטח הרב, שעורר איבר היא מבודדת מן העוברים שליו בוגר במבחנה במערכת organotypic (עד 48 שעות). רקמות בתרבית לאחר מכן מורכבים על גבי מצלמת העובר עוף. לאחר 10 ימים של ovo פיתוח, איברים מגובשת התקבלו ברקמות המושתל. שיטה זו מאפשרת גם את האפנון של מסלולי איתות על ידי הממשל הרגיל של סוכנים תרופתי רקמות מוחיות לאורך שלבים התפתחותיים במבחנה , ב ovo . בנוסף, לפתח רקמות ניתן לאסוף בחלון כל הזמן לנתח שלהם פרופיל ביטוי גנטי (באמצעות ה-PCR כמותי (qPCR), מיקרו-מערכים, וכו ‘), מורפולוגיה (העריכו עם היסטולוגיה קונבנציונאלי, נוגדנים).
ההליך המתואר ניסיוני יכול לשמש ככלי לעקוב אחר היווצרות האיברים בחוץ העובר העופות, בשלבים המוקדמים של organogenesis כדי גובשה במלואה, איברים פונקציונליים.
Introduction
העופות העוברים היה בשימוש נרחב במחקרים הזרע ביולוגיה התפתחותית. היתרונות העיקריים של המודל העופות כוללים את האפשרות לפתוח את הביצה, גישה קלה יחסית של העובר, ואת היכולת לבצע המיקרומניפולציה. כמה דוגמאות מהווים מערכת כמירה שליו-עוף קלאסי ללמוד תא גורל1, יישום של גורמי גדילה ספציפי העובר2, וגידול של מבנים הסלולר חוץ רחמי מצלמת1,3, 4.
כדי לקבל תובנות חדשות שלבים של היווצרות האיברים, לאחרונה פיתחנו שיטה המשלבת טכניקות הרכבה עם מניפולציה במבחנה של רקמות עובריים5. הגישה שני שלבים מאפשר אפליה וחקירה של שניהם – ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של organogenesis, לעתים קרובות מוגבל בשל רקמת דינמיות ומורכבות מאוד אינטראקציות2. יתר על כן, היעדר סמנים רקמות ספציפיות מתאים לעתים קרובות מגביל את השימוש מהונדסים גנטית חיה מודלים6. שיטה זו הרומן של הגישה שני שלבים גוברת במידה רבה על ההגבלות.
ללמוד בשלבים המוקדמים של היווצרות האיברים, בשלב הראשון, הטריטוריה עובריים שליו הכוללת תחילתו איברים פוטנציאליים מבודדים, גדל בכל מערכת organotypic במבחנה במשך 48 שעות. במהלך תקופה זו, אפנון תרופתי של איתות המסלולים ספציפי יכול להתבצע על-ידי הוספת תרופות תרבות בינוני5,7. בנוסף, רקמות בתרבית ניתן לאסוף בכל שלב הצמיחה במבחנה ולהשתמש שנבדק על ביטוי גנים (באמצעות שיטות כגון qPCR, מיקרו-מערכים, וכו ‘).
בשלב השני, רקמות תרבותי h 48 ואז מורכבים על גבי מצלמת העובר עוף (ג) ביום עובריים (E) 8 (cE8) (המבורגר, המילטון (HH)-שלבים 33-35)8. מצלמת מתנהג כספק כלי הדם של חומרים מזינים ומאפשר דלק חילופי1,3,4 לרקמות המושתל הפעלת שלה פיתוח ב ovo עבור תקופות זמן ארוכות יותר. שלב נסיוני זה מתאים במיוחד ללמוד מאחרים-שלבים של organogenesis, כמו איברים מגובשת יכולה להיות מושגת לאחר 10 ימים של ovo פיתוח5,9,10,11 . ניתוח מורפולוגי מתבצע בקלות על ידי היסטולוגיה קונבנציונליות כדי לאשר היווצרות האיברים תקין, התורם מקורם של התאים ניתן לזהות באמצעות אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים תלויי מין (כלומר, MAb שליו PeriNuclear (QCPN)). במהלך תקופת הדגירה קאם, שתלים יכולים גם להיות גדל בנוכחות סוכנים תרופתי ונאסף בכל שלב של פיתוח כדי להעריך את ההתקדמות של organogenesis.
הגישה בשני שלבים, המתוארים כאן לעומק, כבר ננקטה. פיגירדו et al. 5 כדי לחקור את ההתפתחות ראשית יותרת התריס העופות/התימוס נפוצות. בהתאם לכך, את particularities הטבועה של השטחים עובריים, שלבי ההתפתחות מעורב organogenesis של בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס, יוצגו להלן.
בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס epithelia, אבל ברור מבחינה תפקודית, שואבים האנדודרם של השיטה בלוע (PP)12. ב העופות, epithelia של איברים אלה מקורן השלישית והרביעית PP האנדודרם (3/4PP)12, ואילו אצל יונקים האפיתל הרתי נובע 3PP האפיתל של בלוטות יותרת התריס הנגזר מן 3PP 3/4PP עכבר והן האנושיים, בהתאמה13,14.
אחד השלבים המוקדמים ביותר על היווצרות האיברים האלה היא הופעתה של בלוטת התימוס דיסקרטית ותחומים יותרת התריס ב- ראשית נפוצות. עוף, תחומים אלה יכול להיות מזוהה על ידי הכלאה בחיי עיר , עם סמנים מולקולריים ספציפי, E4.515. כמו פיתוח מתקדם, rudiments איברים אלה לבודד, להפריד בין הלוע, בעוד קפסולה mesenchymal דק, נוצר על ידי תאים נגזר הרכס העצבי, מקיף אותם (ב E5; HH-stage 27). בהמשך, האפיתל הרתי התנחלו מאת ובתאים hematopoietic (ב E6.5; HH-stage 30)12.
כמו לימודים קלאסיים שליו-עוף1,12, הגישה שני שלבים שימושי במיוחד ללמוד היווצרות של איברי הלימפה/hematopoietic, כלומר בלוטת התימוס5. כפי explant השליו, עם תחילתו איברים, הוא הושתל ב העובר עוף לפני קדמון hematopoietic תא קולוניזציה, התימוס chimeric הוא הקים עם עוף נישא בדם ובתאים שחדר מקבילה אפיתל הרתי שליו. שיטה זו היא, לכן, כלי שימושי כדי לחקור את התרומה של hematopoietic בתאים הפיתוח של מערכת הלימפה/המטו העופות.
Protocol
Representative Results
Discussion
היבט חיוני להצלחה של שיטה זו הוא איכות עוף והן שליו ביצים. בהתחשב התקופות דגירה ארוך, במיוחד במהלך ovo בתוך וזמינותו, באיכות טובה של ביצי תרנגולת משפר את יכולת הקיום שיעורי (עד 90%) בסוף ההליך. כדי להשיג זאת, לבדוק את הביצים מן הספקים השונים. דגירה הביצים unmanipulated לתקופות ארוכות (עד 16-17 ימים) ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים Cidadão עידו, איזבל Alcobia של פריירה לאונור קריאה ביקורתית בכתב היד, Padma Akkapeddi הקריינות וידאו, ולעשות כדי Vitor Proa מן השירות היסטולוגיה של ה-e אינסטיטוטו Histologia דה Biologia Desenvolvimento, Faculdade דה רפואה de Lisboa, Universidade de Lisboa, לקבלת תמיכה טכנית. אנחנו חבים במיוחד פאולו Caeiro, הוגו סילבה מ Unidade דה audiovisuais (יחידת אורקולי), Faculdade דה רפואה de Lisboa, Universidade de Lisboa על מחויבותם מצטיינים לייצור של וידאו זה. אנו להכיר לייקה מיקרוסיסטמס בחביבות לספק סטריאוסקופ מצויד עם מערכת הוידאו, כדי Interaves – שימור אורח אגרו-Pecuária, s. A משתמשינו שליו מופרית ביצים. עבודה זו נתמכה על ידי דה Faculdade רפואה de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
- Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
- National Research Council. Chapter 6 – Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , (2000).
- Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
- Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).
