İlk - ve geç-aşamalarında Organ oluşumu kuş modelindeki keşfetmek için iki adımlı yaklaşım: timus ve paratiroid bezleri Organogenesis paradigma
Summary
Bu makalede klasik bıldırcın-tavuk chimera sistemin roman vitro ve ovo içinde deneysel prosedürler birleştirerek organ oluşumu, çalışma Güncellenme Zamanı bir yaklaşım sağlar.
Abstract
Kuş embriyo deneysel bir model gelişim biyolojisi seminal buluşlar için son derece önemli olmuştur. Birkaç yaklaşım, bıldırcın-tavuk chimeras oluşumu ve chorioallantoic membran (ektopik doku tarihinden geriye son yüzyılda gelişimi sürdürmek için CAM) kullanımı arasında. Günümüzde, son vitro metodolojileri ile klasik bu tekniklerin birleşimi roman umutları daha fazla organ oluşumu keşfetmek için sunuyor.
Burada ilk – ve geç-aşamalarında organogenesis çalışmaya bir iki adım yaklaşım tarif. Kısaca, embriyonik bölge organ meşru bölge içeren bir organotypic sistemi (en fazla 48 s) içinde bıldırcın embriyo ve yetişkin vitro izole edilmiştir. Kültürlü doku daha sonra tavuk embriyo CAM aşılı. Ovo içinde gelişimi 10 gün sonra tam biçimli organları aşılı dokulardan elde edilir. Bu yöntem aynı zamanda vitro ve ovo içinde gelişimsel adımları boyunca doku genetik manipülasyon ve farmakolojik düzenli yönetim tarafından yolları sinyal modülasyonu sağlar. Ayrıca, onların (kullanarak kantitatif PCR (qPCR), microarrays, vb) gen ekspresyon profili ve Morfoloji (geleneksel Histoloji ve İmmünokimya ile değerlendirildi) çözümlemek için herhangi bir zaman penceresi, dokularda gelişen toplanabilir.
Açıklanan deneysel işlemin organ oluşumu tam olarak kurulan organogenesis erken dönemlerinde ve fonksiyonel organları kuş embriyo dışında takip için bir araç olarak kullanılabilir.
Introduction
Kuş embriyo seminal gelişim biyolojisi çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Kuş modelinin başlıca avantajları açmak için yumurta, embriyo ve embriyolardan gerçekleştirmesini nispeten kolay erişim imkanı bulunmaktadır. Bazı örnekler hücre kader1, uygulama2embriyo için belirli büyüme faktörlerinin ve CAM1,3ektopik hücresel yapılar büyüme çalışmak için klasik bıldırcın-tavuk chimera sistemi oluşturan, 4.
Organ oluşumu farklı aşamalarında yeni görüşler elde etmek için biz son zamanlarda embriyonik dokular5 vitro manipülasyon ile aşılama teknikleri birleştiren bir yöntem geliştirdik. Ayrımcılık ve keşif, her iki erken – ve geç-sık sık son derece dinamik ve karmaşık doku etkileşimleri2nedeniyle sınırlı dönemlerinde organogenesis, iki aşamalı yaklaşım sağlar. Ayrıca, uygun doku özgü işaretleri eksikliği sık genetik olarak değiştirilmiş kısıtlar hayvan modelleri6. Bu roman yöntemi iki aşamalı yaklaşım, büyük ölçüde bu tür sınırlamalar üstesinden gelir.
Erken aşamalarında organ oluşumu, ilk adım, eğitim için potansiyel organ rudiment oluşan bıldırcın embriyonik bölge izole ve 48 h bir vitro organotypic sisteminde büyüdü. Bu dönemde belirli sinyal yollar farmakolojik modülasyon kültür orta5,7‘ ye uyuşturucu ekleyerek gerçekleştirilir. Ayrıca, kültürlü doku vitro büyüme herhangi bir aşamada toplanan olabilir ve gen-ifade için probed (qPCR, microarrays, vbgibi yöntemleri kullanarak).
İkinci adımda, 48 h kültürlü dokulara sonra tavuk (c) embriyo (cE8) embriyonik gün (E) 8, CAM aşılı (Hamburger ve Hamilton (HH)-33-35 aşamalarında)8. CAM besin vasküler bir tedarikçi olarak davranır ve onun geliştirme ovo içinde daha uzun süreler için etkinleştirme aşılı dokulara gaz alışverişi1,3,4 sağlar. Tam biçimli organları içinde ovo geliştirme5,9,10,11 10 gün sonra elde edilebilir gibi bu deneysel adım özellikle de geç-aşamaları organogenesis, çalışmaya uygun . Morfolojik analiz kolayca uygun organ oluşumu onaylamak için geleneksel Histoloji tarafından gerçekleştirilir ve donör kökenli hücre species-specific antikorlar (yani, MAb bıldırcın Perinükleer (QCPN)) kullanarak immünhistokimya tarafından belirlenebilir. CAM kuluçka döneminde Greftler Ayrıca huzurunda farmakolojik ajanlar yetiştirilen ve herhangi bir organogenesis ilerlemesini değerlendirmek için geliştirme aşamasında toplanan.
Burada ayrıntılı olarak açıklanan iki aşamalı yaklaşım zaten Figueiredo vd. istihdam kuş paratiroid/timus ortak primordium geliştirme keşfetmek için 5 . Buna göre embriyonik topraklarının doğal özellikleri ve timus ve paratiroid bezleri içinde organogenesis ilgili gelişme aşamalarında aşağıda sunulacak.
Timus ve paratiroid bezleri epiteli, işlevsel olarak farklı olsa da, faringeal torbalar endoderm (PP)12türetmek. İçinde kuş, bu organların epiteli üçüncü ve dördüncü PP endoderm (3/4PP)12den, memelilerde timik epitel 3PP türeyen ve paratiroid bezleri epitel elde etmek 3PP ve 3/4PP fare ve insan kaynaklı, sırasıyla13,14.
Bu organların oluşumu en erken aşamalarında biridir ayrı timus ve paratiroid etki alanlarında ortak primordium ortaya çıkması. Tavuk, bu etki alanları, E4.515belirli moleküler imleçli in situ hibridizasyon tarafından belirlenebilir. Geliştirme devam ettikçe, bu organ esaslar kişiselleştirmek ve nöral crest kaynaklı hücreler tarafından ince bir mezenkimal kapsül (E5; onları çevreleyen iken yutak ayrı HH-stage 27). Daha sonra timik epitel (E6.5; hematopoetik progenitör hücreler tarafından kolonize HH-stage 30)12.
Klasik bıldırcın-tavuk çalışmalar1,12olduğu gibi iki aşamalı yaklaşım hematopoetik/lenfoid organlar, yani timus5oluşumunu incelemek özellikle yararlıdır. Bıldırcın, organ rudiment ile explant olarak aşılı hematopoetik progenitör hücre kolonizasyon önce tavuk embriyo chimeric timus bir bıldırcın timik epitel muadili infiltre tavuk kan yoluyla progenitör hücre ile oluşturulur. Bu yöntem, bu nedenle, kuş hemato/lenfoid sistemi geliştirilmesi hematopoetik hücrelerin katkısını keşfetmek için yararlı bir araçtır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntemin başarısı için çok önemli bir yönü kalitesidir tavuk ve Bıldırcın yumurta. Göz önüne alarak uzun bir kuluçka dönemlerde, özellikle içinde ovo tahlil, kaliteli tavuk yumurta geliştirir canlılığı yordamının sonuna (%90) oranları. Bunu başarmak için yumurta farklı tedarikçilerden sınayın. Uzun süre unmanipulated yumurtaları kuluçkaya (ilâ 16-17 gün) ve gelişimlerini kontrol edin. Kaliteli toplu değerlendirilmesi için embriyo % 80’den fazla normal gelişim mevcut o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar António Cidadão, Isabel Alcobia ve Leonor Parreira Padma Akkapeddi video anlatım için için el yazması eleştirel okuma için minnettarız ve Instituto de Histologia e Histoloji hizmetinden Vitor Proa için Biologia yapın Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, teknik destek için. Unidade de audiovisuais (görsel-işitsel birimi), Faculdade de Paulo Caeiro ve Hugo Silva için özellikle borçlu olduğumuzu Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa olağanüstü bağlılıklarını bu video üretimi için. Lütfen Interaves ve video sistemi ile donatılmış bir stereoscope sağlamak için Leica Microsystems anıyoruz – Sociedade Agro-Pecuária, S.A bıldırcın ile katkıda bulunmak için yumurta döllenmiş. Bu eser Faculdade de tarafından desteklenen Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
- Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
- National Research Council. Chapter 6 – Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , (2000).
- Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
- Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).
