בידוד והתרבות של מכרסמים מיקרוגלייה לקדם דינאמי כחוד מורפולוגיה במדיום נטול סרום

Summary

יש כבר נכשל בשל מאמצים כדי להבין microglial פונקציה בפירוט חוסר בדגמי תרבות microglial לסכם את מאפייני מיקרוגלייה בוגרת ויוו . פרוטוקול זה מתאר גישה בידוד ותרבות שנועדו לשמור על ההישרדות חזקים של עכברים בוגרים מאוד כחוד מיקרוגלייה בתנאים מוגדרים-בינוני.

Abstract

מיקרוגלייה לייצג 5-10% של כל התאים במערכת העצבים המרכזית (CNS), יותר ויותר מושכים תשומת לב בשל תרומתם במהלך הפיתוח, הומאוסטזיס, ומחלות. למרות מקרופאגים נחקרו בפירוט במשך עשרות שנים, תכונות מיוחדות של מיקרוגלייה, את המקרופאגים רקמות תושב של מערכת העצבים, נותרו במידה רבה מסתורי, בין השאר בשל מגבלות ביכולת להתרכז microglial בוגרת מאפיינים בתרבות. כאן, אנחנו להמחיש תהליך פשוט לבידוד מהירה של מיקרוגלייה טהור מהמוח מכרסמים בוגרת. אנו מתארים גם תנאים תרבות ללא סרום התומכים רמות גבוהות של הכדאיות microglial לאורך זמן. מיקרוגלייה תרבותי בתנאים אלה מוגדרים-בינוני התערוכה תהליכים כחוד משוכלל והתנהגות מעקב דינמי. אנו להמחיש כמה תופעות של סרום חשיפה על מיקרוגלייה בתרבית, לדון איך תרבויות אלה ללא סרום בהשוואה הן תרבויות החשופים סרום, כמו גם מיקרוגלייה בתוך vivo.

Introduction

כמו מקרופאגים של CNS parenchyma, מיקרוגלייה לקיים אינטראקציה עם מגוון רחב של מעגלים עצביים ורשתות איתות גליה. הם ממלאים תפקיד חיוני בתחום הפיתוח הומאוסטזיס של המוח באמצעות גיזום סינפטית, סיווג תא אפופטוטיים להיפגע, ארעית אינטראקציות עם תהליכים עצביים^1,2. מיקרוגלייה הם המגיבים מוקדם כדי מפציעות נוירולוגיים, הרחבת תהליכי שלהם ארוך, דק לאתרים הנגע לתאם תגובות דלקתיות ולהגביל המדמם^3,4. שינויים microglial מורפולוגיה ומתפקדים בכל מקום פציעות CNS אקוטי וכרוני, נספח מיקרוגלייה שינו מורפולוגיה, לוקליזציה, ביטוי של מתווכים דלקתיים ב מגוון רחב של מחלות הברית¹. מחקרים גנטיים בבני אדם מציינים כי מוטציות שמשנות סיכון למחלות ניווניות בעיקר לעיתים קרובות או באופן בלעדי מבוטאים על-ידי מיקרוגלייה ב מערכת העצבים ללא פגע, הצבעה על תפקיד קריטי עבור מיקרוגלייה בפתוגנזה של המחלה או התקדמות⁵ . בהתחשב שהמוניטין שלהם, פציעות ומחלות, בהבנה של ביולוגיה microglial הוא בעדיפות גבוהה לפיתוח גישות טיפוליות חדשות.

רבים ההתקדמות קריטית להבנת הביולוגיה microglial נרקמו על ידי חיוץ שיטות ומנגנונים שהתגלו במחקרים של אוכלוסיות אחרות מקרופאג כולל שיטות, ביטוי גנים פרופילים של הגדרות של פונקציונלי / מורפולוגי של הברית. למרות מוכללת מקרופאג פונקציות לעתים קרובות לשחק בדרכים מפתיעות בתוך נוף CNS, מיקרוגלייה הם עצמם מאוד מיוחדים, מפגין חתימה ביטוי גנים ייחודיים המציבה אותם מלבד רקמות אחרות ומורפולוגיה כחוד מקרופאגים⁶. מיקרוגלייה יש שושלת זו נבדלת מקרופאגים רקמות ביותר אחרים; לישוב מערכת העצבים במהלך גל עובריים של hematopoiesis פרימיטיבית, מוקדם והם לחדש עצמי לאורך החיים, עצמאית התרומות סופית hematopoiesis⁷. החתימה ביטוי גנים לבגרות מלאה של מיקרוגלייה למבוגרים לא מושגת עד שבוע לאחר הלידה השניה⁸. רמזים סביבתיים מן הרקמה שמסביב לשחק תפקיד מרכזי הכתבת רקמות ספציפיות מקרופאג תכונות⁶, הכולל ב מערכת העצבים חשיפה מוגבלת נישא בדם גורמים שהעניק את מחסום הדם – מוח⁹.

מכשול אחד להבנת באופן מלא microglial תרומות CNS הומאוסטזיס ומחלות הוא הקושי של recapitulating מאפיינים מיוחדים של בוגרת מיקרוגלייה ראיתי ויוו עם תאים מטוהרים במבחנה. שיטות רבות פותחו כדי לבודד, תרבות מיקרוגלייה ללא פגע, אבל רוב הגישות להסתמך על סרום כדי לתמוך הישרדות cell. הראינו כי תוספת של סרום, אשר הוא ריאגנט מטבעו משתנה המכיל מגוון רחב של מולקולות ביו, בעייתית במיוחד כאשר עבודה עם מיקרוגלייה כי הוא מקדם של מורפולוגיה amoeboid, גדל התפשטות, ו phagocytosis מוגברת⁹ הנצפה לעתים קרובות vivo כאשר מיקרוגלייה נחשפים דם נישא גורמים לאחר ערעור מחסום הדם – מוח. על ידי מדדים אלה, תאים החשופים הנסיוב דומה מיקרוגלייה פציעה או מחלה, אבל שינויים כאלה מופחתים מתי מיקרוגלייה מתורבתים מדיום הגידול מוגדרים המכילים נוזל מוחי-שדרתי-1 (או איל-34), TGF-β, כולסטרול ו הסלנייט.

פרוטוקול זה מספק פרטים culturing עכברוש לנוער מיקרוגלייה בתנאים ללא סרום, הקשורים בעבודה שפורסם לאחרונה⁹. פרוטוקול זה התייעלה עבור חולדות מיום כמחנכת 21-30 (P21 – P30), אך ניתן להתאים כדי לבודד מיקרוגלייה של חולדות ועכברים בכל גיל, למרות התשואה ואת הכדאיות הכוללת ישתנו בהתאם מינים של גיל של החיה. התשואות מקסימלי ואת הכדאיות המיטבית מושגת כאשר משתמשים מעט ילדותית מיקרוגלייה (~ P9), עם תשואות הכדאיות בהדרגה אובליסק במידת מה רמות נמוכות יותר בבעלי חיים למבוגרים. מיקרוגלייה ניתן גם מבודד מן העכברים, אבל מצאנו כי תאים עכברוש להראות גבוה משמעותית בתשואות, הכדאיות ומורכבות של כחוד מורפולוגיות, בהשוואה לתאים העכבר בתרבויות ללא סרום. בעלי חיים בגיל גדול יותר P50 לא הוערכו עם פרוטוקול זה. הליך בידוד immunopanning מוטבה כדי למזער את השינויים בפרופילי תעתיק microglial במהלך בידוד, כדי למקסם את הכדאיות במורד הזרם של התאים. באמצעות טכניקות אלה ניסוחים מדיה, גבוהה-יכולת הקיום העיקרי תרבויות יכול להתקיים במשך שבועות. מיקרוגלייה תרבותי בתנאים אלה שהפגינו מורפולוגיה כחוד מאוד מעורבים הרחבה מהירה ו הכחשה של תהליכים, נמוכה יחסית המחירים של התפשטות. להדגיש את חשיבות סרום-חשיפה על מאפיינים אלה, ואנו נדבר על נקודות החוזק והחולשה של שיטה זו ביחס גישות אחרות.

Protocol

בכל ההליכים הכרוכים מכרסמים תאמו הנחיות אוניברסיטת סטנפורד, העומדים בתקני הלאומי ואת חוקי המדינה ומדיניות. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי פאנל ניהול באוניברסיטת סטנפורד על מעבדה חיה על עצמך. הערה: כל פתרון, מאגר של יצירות הינם מסופקים בכל טבלה של חומרים. <p class…

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי מיקרוגלייה טוהר גבוהה כחוד תרבות של חולדות לנוער. תוצאות דומות ניתן להשיג באמצעות בעלי חיים ילדותית, הלידה, למבוגרים, כפי שמתואר להלן. מאז תא ומשום כוללים לעיתים קרובות בניואנסים, הזדמנויות רבות עבור תאים למות, השתמשנו בקרת איכות מחסומים כדי לקב?…

Discussion

כיוון מיקרוגלייה לשמש תאים חיסוניים הפלאג של מערכת העצבים, הן מאוד קשוב לשינויים סביבתיים; לכן, זהירות רבה נדרשת כדי למזער את תגובות דלקתיות בתוך התאים במהלך הבידוד שלהם ואת התרבות⁸. זו מושגת ב פרוטוקול זה דרך טמפרטורה ומהירות. שמירה על התאים על קרח או ב 4 ° C בכל האפשר מקטינה בא?…

Materials

Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.