Isolatie en cultuur van knaagdier Microglia ter bevordering van een dynamische vertakt morfologie in serumvrij Medium

Summary

Inspanningen om microglial functie in detail te begrijpen hebben belemmerd door het ontbreken van microglial cultuur modellen die de eigenschappen van volwassen in vivo microglia recapituleren. Dit protocol beschrijft een aanpak van het isolement en cultuur ontworpen om robuust voortbestaan van zeer vertakte volwassen rat microglia voorwaarden gedefinieerd-medium.

Abstract

Microglia vormen 5-10% van alle cellen van het centrale zenuwstelsel (CNS) en zijn steeds meer aandacht als gevolg van hun bijdragen tijdens de ontwikkeling, homeostase en ziekte. Hoewel macrofagen zijn in detail bestudeerd voor decennia, speciale functies van microglia, de weefsel-ingezeten macrofagen van het centraal zenuwstelsel, gebleven grotendeels mysterieus, gedeeltelijk als gevolg van beperkingen in de mogelijkheid om te recapituleren volwassen microglial eigenschappen in cultuur. We illustreren hier, een eenvoudige procedure voor de snelle isolatie van pure microglia van de volwassen knaagdieren hersenen. Ook beschrijven we serumvrij kweekomstandigheden die ondersteuning bieden voor hoge niveaus van microglial levensvatbaarheid na verloop van tijd. Microglia gekweekt onder deze omstandigheden gedefinieerd-medium exposeren uitgebreide vertakte processen en dynamische toezicht gedrag. We illustreren sommige gevolgen van serum blootstelling voor gekweekte microglia en bespreken hoe deze serumvrij culturen te vergelijken met zowel serum-blootgesteld culturen evenals microglia in vivo.

Introduction

Als de macrofagen van de CNS parenchym, microglia interactie met een uitgebreid scala aan circuits van neuronale en gliale signalering netwerken. Ze spelen een cruciale rol in de ontwikkeling en de homeostase van de hersenen via synaptic snoeien, apoptotic cel goedkeuring en voorbijgaande interacties met neuronale processen^1,2. Microglia zijn vroege responders aan neurologische letsels, uitbreiding van hun lange, dunne processen naar laesie sites beperken bloeden^3,4te coördineren van inflammatoire reacties. Veranderingen in microglial morfologie en functie zijn alomtegenwoordig in zowel acute als chronische CNS verwondingen en microglia tentoonstelling gewijzigd morfologie, lokalisatie en expressie van inflammatoire mediatoren in een breed scala aan ziekte staten¹. Menselijke genetische studies blijkt dat mutaties die veranderen van risico voor neurodegeneratieve ziekten vaak voornamelijk of uitsluitend worden uitgedrukt door microglia in het intact VNV, wijzend naar een cruciale rol voor microglia in de pathogenese van de ziekte of progressie⁵ . Gezien hun bekendheid bij letsel en ziekte, is bevordering van het begrip van microglial biologie een hoge prioriteit voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen.

Vele kritische voorschotten aan het begrip van microglial biologie gerezen door extrapolatie van de technieken en mechanismen in het onderzoek van de populaties van andere macrofaag waaronder kweekmethoden, gen expressieprofielen en definities van functionele ontdekt / morfologische Staten. Hoewel generalized macrofaag functies vaak op verrassende manieren binnen de CNS-landschap spelen, microglia zelf sterk gespecialiseerd, vertonen een vertakte morfologie en een unieke gen expressie handtekening dat hen onderscheidt van ander weefsel macrofagen⁶. Microglia hebben een afkomst die verschilt van de meeste andere macrofagen weefsel; ze koloniseren de CNS tijdens een vroege embryonale Golf van primitieve Haematopoiese en zelf vernieuwen gedurende het hele leven, onafhankelijk van de bijdragen van definitieve Haematopoiese⁷. De volwassen gen expressie ondertekening van volwassen microglia wordt niet bereikt tot de tweede postnatale week⁸. Milieu signalen uit het omringende weefsel spelen een belangrijke rol in het weefsel-specifieke macrofaag functies⁶, waarin in het VNV beperkte blootstelling aan bloed overgedragen factoren die worden verleend door de bloed – hersenbarrière⁹dicteren.

Een obstakel voor het volledig begrip van microglial bijdragen aan CNS homeostase en ziekte is de moeilijkheid van de gespecialiseerde eigenschappen van volwassen microglia gezien in vivo met gezuiverde cellen Recapitulerend in vitro. Veel methoden zijn ontwikkeld om te isoleren en cultuur intact microglia, maar de meeste benaderingen rekenen op serum ter ondersteuning van de overleving van de cel. We hebben aangetoond dat toevoeging van serum, dat is een inherent variabele reagens met een breed scala van biologische actieve moleculen, is met name problematisch wanneer werken met microglia omdat het bevordert een Wortelpotigen morfologie, verhoogd proliferatie, en verhoogde fagocytose⁹ vaak gezien in vivo wanneer microglia worden blootgesteld aan bloed gedragen factoren na de verstoring van de bloed – hersenbarrière. Door deze statistieken, serum-blootgesteld cellen lijken op microglia letsel of ziekte staten, maar dergelijke veranderingen worden verlaagd wanneer microglia worden gekweekt in de gedefinieerde groeimedium met CSF-1 (of IL-34), TGF-β, cholesterol en seleniet.

Dit protocol biedt details voor het kweken van jonge rat microglia onder serumvrij voorwaarden, in verband met de onlangs gepubliceerde werk⁹. Dit protocol is gestroomlijnd voor ratten uit postnatale dag 21-30 (P21 – P30), maar kan worden aangepast aan het isoleren van microglia van ratten en muizen van elke leeftijd, hoewel opbrengst en algehele levensvatbaarheid is afhankelijk van de soort en de leeftijd van het dier. Maximale opbrengsten en optimale levensvatbaarheid wordt bereikt bij het gebruik van iets onvolwassen microglia (~ P9), met opbrengsten en levensvatbaarheid geleidelijk taps toelopende tot enigszins lagere niveaus in de volwassen dieren. Microglia kan ook geïsoleerd van muizen, maar we hebben gevonden dat de rat cellen tonen beduidend hogere opbrengsten, levensvatbaarheid en complexiteit van vertakte morphologies, in vergelijking met de muis cellen in serumvrij culturen. Dieren ouder groter is dan P50 zijn niet geëvalueerd met dit protocol. Deze immunopanning isolatie procedure is geoptimaliseerd om te minimaliseren van wijzigingen in microglial transcriptionele profielen tijdens isolatie en te maximaliseren downstream levensvatbaarheid van de cellen. Met behulp van deze technieken en media formuleringen, kunnen hoge-levensvatbaarheid primaire culturen weken worden volgehouden. Microglia gekweekt onder deze omstandigheden vertonen een zeer vertakte morfologie waarbij snelle uitbreiding en intrekking van processen en relatief lage tarieven van proliferatie. We wijzen op de betekenis van de serum-blootstelling op deze eigenschappen, en bespreken van de sterke punten en zwakheid van deze methode ten opzichte van andere benaderingen.

Protocol

Alle procedures waarbij knaagdieren voldaan aan Stanford University richtsnoeren, die in overeenstemming met nationale en staatswetten en beleid. Alle dierlijke procedures goedgekeurd door Stanford University’s administratieve Panel op Laboratory Animal Care. Opmerking: Alle composities van de oplossing en buffer vindt u in de Tabel van materialen. 1. Prepareer een petrischaal CD11b Immunopanning (dag 0) Opmerking: 1 immuno…

Representative Results

Dit protocol wordt een methode beschreven om cultuur hoge zuiverheid vertakt microglia van jonge ratten. Vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen met behulp van onrijpe, perinatale en volwassen dieren, zoals hieronder besproken. Omdat cel isolatie vaak bevatten subtiele nuances en veel mogelijkheden voor cellen om te sterven, wij gewend kwaliteitscontrole controlepunten helpen bepalen succes op verschillende stappen. Wij gecontroleerd meestal schorsingen van de cel met behulp van …

Discussion

Omdat microglia dienen als sentinel immuuncellen van het centraal zenuwstelsel, zijn ze zeer soepel reageren op veranderingen in het milieu; Daarom is zorgvuldig vereist om te minimaliseren van inflammatoire reacties binnen de cellen tijdens hun isolement en de cultuur⁸. Dit wordt bereikt in dit protocol door snelheid en temperatuur. Het houden van de cellen op ijs of bij 4 ° C wanneer mogelijk sterk activering, vermindert zodat alle centrifugeren stappen bij 4 ° C plaatsvinden, de dieren zijn g…

Materials

Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.