Summary

Isolement et Culture des microglies rongeurs pour promouvoir une dynamique ramifié morphologie dans un milieu sans sérum

Published: March 09, 2018
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Summary

Efforts pour comprendre en détail le fonctionnement du microgliales ont été entravées par le manque de modèles de culture microgliales qui récapitule les propriétés des matures in vivo de cellules microgliales. Ce protocole décrit une démarche d’isolement et de la culture visant à maintenir la survie robuste des microglies rat mature très ramifié dans des conditions définies et moyen.

Abstract

La microglie représentent 5 à 10 % de toutes les cellules du système nerveux central (SNC) et sont plus en plus attirant l’attention en raison de leurs contributions au cours de développement, l’homéostasie et la maladie. Bien que les macrophages ont été étudiés en détail pour des décennies, des fonctionnalités spécialisées des microglies, les macrophages tissulaires-résident du SNC, sont restés en grande partie mystérieuse, en partie à cause de limitations dans la capacité de récapituler des microglies mature biens immobiliers à la culture. Ici, nous montrons une procédure simple et directe pour l’isolement rapide de pure microglie du cerveau mature rongeur. Nous décrivons également les conditions de culture sans sérum qui prennent en charge des niveaux élevés de viabilité microgliales au fil du temps. Cultivées dans ces conditions de milieu défini la microglie pièce complexes processus ramifiés et comportement dynamique de surveillance. Nous illustrons quelques effets de l’exposition de sérum sur des microglies culture et examiner comment ces cultures sans sérum comparent à la fois exposés au sérum de cultures ainsi que la microglie in vivo.

Introduction

Comme les macrophages du parenchyme CNS, microglie interagir avec une vaste gamme de circuit neuronal et gliales réseaux de signalisation. Ils jouent un rôle vital dans le développement et l’homéostasie du cerveau par élagage synaptique, dégagement de cellules apoptotiques et transitoires interactions avec les processus neuronaux1,2. Les microglies sont premiers intervenants de lésions neurologiques, étendre leurs processus longs et minces aux sites de la lésion pour coordonner les réactions inflammatoires et de limiter les saignements3,4. Changements dans la morphologie des microglies et la fonction sont omniprésents dans les blessures de CNS aiguës et chroniques et la microglie pièce modifiée morphologie, localisation et l’expression de médiateurs inflammatoires dans un large éventail d’États de maladie1. Des études génétiques humains indiquent que les mutations qui modifient le risque de maladies neurodégénératives sont souvent principalement ou exclusivement exprimées par la microglie dans le SNC intact, pointant vers un rôle critique pour la microglie dans la pathogenèse de la maladie ou la progression5 . Compte tenu de leur importance dans les blessures et les maladies, favoriser la compréhension de la biologie de la microglie est hautement prioritaire pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Nombreuses avancées essentielles à la compréhension de la biologie des microglies ont surgi en extrapolant des techniques et mécanismes découverts dans les études d’autres populations de macrophage, y compris les méthodes de culture, profils d’expression génique et définitions de fonctionnelle / morphologiques États. Bien que généralisée macrophage fonctions souvent se dérouler de façon surprenante dans le paysage de la CNS, les microglies sont elles-mêmes hautement spécialisé, présentant une morphologie ramifiée et une signature d’expression de gène unique qui les distingue des autres tissus macrophages6. La microglie ont une lignée qui se distingue de la plupart des autres macrophages tissulaires ; ils colonisent le système nerveux central au cours d’une vague embryonnaire précoce de l’hématopoïèse primitif et se renouvellement tout au long de la vie, indépendamment des contributions de l’hématopoïèse définitive7. La signature d’expression de gène de pleine maturité des microglies adulte n’est pas atteint jusqu’à la deuxième semaine après la naissance8. Les signaux environnementaux des tissus environnants jouent un rôle majeur en dictant des macrophages de tissu-spécifiques caractéristiques6, qui dans le système nerveux central comprend une exposition limitée à facteurs hématogène accordée par la barrière hémato – encéphalique9.

Un obstacle pour comprendre pleinement microgliales contributions à l’homéostasie du CNS et de la maladie est la difficulté de récapitulant les propriétés spécialisées des microglies mature vu en vivo avec cellules purifiées in vitro. Plusieurs méthodes ont été développées pour isoler et culture microglie intacte, mais la plupart des approches dépendent de sérum à l’appui de la survie des cellules. Nous avons montré que l’addition de sérum, qui est un réactif par nature variable contenant une vaste gamme de molécules bioactives, est particulièrement problématique lorsque travailler avec les cellules microgliales parce qu’elle encourage une morphologie amiboïde, augmente la prolifération, et phagocytose accrue9 a souvent vu dans vivo quand microglie sont exposés à des facteurs de diffusion hématogène après la rupture de la barrière hémato – encéphalique. Par ces mesures, exposés au sérum de cellules ressemblent à des microglies de blessures ou de maladies, mais ces altérations sont réduites quand les microglies sont cultivées en milieu défini contenant du CSF-1 (ou IL-34), le TGF-β, cholestérol et sélénite.

Ce protocole fournit des détails pour la culture des microglies rat juvénile dans des conditions sans sérum, associés à des travaux récemment publiés9. Ce protocole a été simplifié pour les rats de jour après la naissance 21-30 (P21 – P30), mais peut être adapté pour isoler la microglie de rats et de souris de n’importe quel âge, bien que le rendement et la viabilité globale variera selon l’espèce et l’âge de l’animal. Rendement maximal et viabilité optimale est obtenue lors de l’utilisation des microglies légèrement immatures (~ P9), avec des rendements et de la viabilité s’amenuisant progressivement à un peu plus faibles chez les animaux adultes. Microglies peuvent aussi être isolé chez des souris, mais nous avons trouvé que des cellules de rat montrent des rendements significativement plus élevée, la viabilité et complexité des morphologies ramifiés, comparativement aux cellules de la souris dans les cultures sans sérum. Animaux âgés de plus de P50 n’ont pas été évalués avec ce protocole. Cette procédure d’isolement d’immunopanning a été optimisée afin de minimiser les variations des profils transcriptionnelle microgliales lors de l’isolation et de maximiser la viabilité des cellules en aval. En utilisant ces techniques et les formulations de médias, des cultures primaires de haute-viabilité peuvent être maintenues pendant des semaines. Cultivées dans ces conditions la microglie présentent une morphologie très ramifiée impliquant rapide et la rentrée des processus et relativement faible taux de prolifération. Nous mettre en évidence l’importance du sérum-exposition sur ces propriétés et discuter des points forts et les faiblesses de cette méthode par rapport à d’autres approches.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des rongeurs étaient conformes aux directives de l’Université de Stanford, conformes aux politiques et lois étatiques et nationales. Toutes les procédures d’animaux ont été approuvées par la Commission Administrative de l’Université de Stanford sur la protection des animaux de laboratoire. NOTE : Toutes les compositions de solution et le tampon sont fournies dans la Table des matières. 1. Préparez une…

Representative Results

Ce protocole décrit une méthode de culture haute pureté ramifiée microglie de jeunes rats. Résultats similaires peuvent être obtenus utilisant des animaux immatures, périnatales et adultes, tel que discuté ci-dessous. Étant donné que l’isolement de cellules comprendre souvent des nuances subtiles et nombreuses possibilités pour les cellules à mourir, nous avons utilisé points de contrôle de contrôle de la qualité pour aider à déterminer le succès à différentes étap…

Discussion

Parce que les cellules microgliales servent de cellules immunitaires sentinelles du SNC, ils sont très sensibles aux changements environnementaux ; par conséquent, grand soin est nécessaire pour minimiser les réactions inflammatoires dans les cellules au cours de leur isolement et de culture8. Ceci est accompli dans le présent protocole par le biais de vitesse et de température. Chaque fois que possible réduit considérablement l’activation, donc toutes les étapes de centrifugation ont …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le Christopher et Dana Reeve Foundation International Consortium de recherche sur la moelle épinière, le Dr Miriam et Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, la Fondation de JPB, l’Institut Novartis de la recherche fondamentale, contributions généreuses de Vincent et Stella Coates et la Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).

Materials

Rat: Sprague-Dawley Charles River Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) Bio-Rad Cat# MCA275R Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1  Abcam Cat# AB5076 Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67  Abcam  Cat# AB15580 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 Invitrogen Cat# 11055 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 Invitrogen Cat# A-21203 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 Invitrogen Cat# A-31573 Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining) Thermo Fisher Cat# 28313
Heparan sulfate Galen Laboratory Supplies Cat# GAG-HS01
Heparin Sigma  Cat# M3149
Peptone from milk solids Sigma Cat# P6838
TGF-β2 Peprotech Cat# 100-35B
Murine IL-34 R&D Systems Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol Avanti Polar Lipids Cat# 700000P
Collagen IV Corning  Cat# 354233
Oleic acid Cayman Chemicals  Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid Cayman Chemicals  Cat# 20606
Calcein AM dye Invitrogen Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1 Invitrogen Cat# E1169
DNaseI Worthington Cat# DPRFS
Percoll PLUS GE Healthcare Cat# 17-5445-02
Trypsin  Sigma Cat# T9935
DMEM/F12 Gibco Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin Gibco Cat# 15140-122
Glutamine Gibco Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine  Sigma Cat# A9165
Insulin Sigma Cat# 16634
Apo-transferrin  Sigma Cat# T1147
Sodium selenite Sigma Cat# S-5261
DMEM (high glucose) Gibco Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G Southern Biotech Cat# 0100-20 
Poly-D-Lysine  Sigma Cat# A-003-E
Primaria Plates  VWR Cat# 62406-456
Name Company Catalog Number Comments
Stock reagents 
Apo-transferrin Reconstitution: 10 mg/mL in PBS
Concentration used: 1:100
Storage: -20°C
N-acetyl cysteine Reconstitution: 5 mg/mL in H2O
Concentration used: 1:1,000
Storage: -20°C
Sodium selenite Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O
Concentration used: 1:25,000
Storage: -20°C
Collagen IV Reconstitution: 200 μg/mL in PBS
Concentration used: 1:100
Storage: -80°C
TGF-b2 Reconstitution: 2 mg/mL in PBS
Concentration used: 1:1,000
Storage: -20°C
IL-34 Reconstitution: 200 μg/mL in PBS
Concentration used: 1:1,000
Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol
Concentration used: 1:1,000
Storage: -20°C
Heparan sulfate Reconstitution: 1 mg/mL in H2O
Concentration used: 1:1,000
Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol
Concentration used: 1:1,000
Storage: -20°C
Heparin Reconstitution: 50 mg/mL in PBS
Concentration used: 1:100
Storage: -20°C
Name Company Catalog Number Comments
Solutions 
Perfusion Buffer Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)
Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++
Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM) Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite
Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2
Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)  Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid
Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.

References

  1. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
  2. Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).
  3. Lou, N., et al. Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).
  4. Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).
  5. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  6. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  7. Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages. Front Immunol. 6, 486 (2015).
  8. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  9. Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
  10. Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. Myeloid Cells in the Central Nervous System. Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).

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Cite This Article
Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. J. Vis. Exp. (133), e57122, doi:10.3791/57122 (2018).

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