Isolasjon og kultur av gnager Microglia å fremme en dynamisk Ramified morfologi i Serum-free Medium

Summary

Innsats for å forstå microglial funksjonen i detalj har blitt hindret av mangelen på microglial kultur modeller som recapitulate egenskapene for eldre i vivo microglia. Denne protokollen beskriver isolasjon og kultur tilnærming beregnet på vedlikeholde robuste overlevelse av svært ramified modent rotta microglia under definert mellomstore forhold.

Abstract

Microglia utgjør 5-10% av alle sentralnervesystemet (CNS) celler og økende grad trekker oppmerksomhet deres bidrag under utvikling, homeostase og sykdom. Selv om makrofager har vært studert i detalj for tiår, spesialiserte funksjoner av microglia, vev-resident makrofager av CNS, har vært i stor grad mystisk, delvis på grunn av begrensninger i kunne recapitulate moden microglial egenskaper i kultur. Her viser vi en ukomplisert prosedyre for rask isolering av ren microglia fra modne gnager hjernen. Vi beskriver også serum-free oppdrettsforholdene som støtter høye nivåer av microglial levedyktighet over tid. Microglia kultivert under disse definert mellomstore forholdene utstilling forseggjort ramified prosesser og dynamisk overvåking atferd. Vi illustrerer noen effekter av serum eksponering på kulturperler microglia og diskutere hvordan disse serum-free kulturer i forhold til både serum-eksponerte kulturer samt microglia i vivo.

Introduction

Som makrofager av CNS parenchyma, microglia samhandle med et stort utvalg av nevrale kretser og glial signalnettverk nettverk. De spiller viktige roller i utviklingen og homeostase i hjernen gjennom synaptic beskjæring, apoptotisk celle klarering og transient interaksjoner med neuronal prosesser^1,2. Microglia er tidlig responders for nevrologiske skader, utvide sine lange, tynne prosesser til lesjon steder å koordinere inflammatorisk svar og begrense blødning^3,4. Endringene i microglial morfologi og funksjon er allestedsnærværende i både akutte og kroniske CNS skader, og microglia utstillingen endret morfologi, lokalisering og uttrykk for inflammatoriske mediatorer i en rekke ulike sykdom stater¹. Menneskelige genetiske studier indikerer at mutasjoner som endrer risiko for nevrodegenerative sykdommer er ofte overveiende eller utelukkende uttrykt av microglia i intakt CNS peker til en avgjørende rolle for microglia i patogenesen ved sykdom eller progresjon⁵ . Gitt deres framtredende i skader og sykdom, er fremme forståelsen av microglial biologi svært viktig for å utvikle nye terapeutiske metoder.

Mange viktige fremskritt til forståelsen av microglial biologi har oppstått ved å ekstrapolere teknikker og mekanismer i studier av andre macrophage befolkningsgrupper inkludert kultur metoder, gene uttrykket profiler og definisjoner av funksjonell / morfologiske stater. Selv om generalisert macrophage funksjoner ofte spilt på overraskende måter i CNS landskapet, microglia er selv høyt spesialiserte, viser en ramified morfologi og en unik gene expression signatur som skiller dem fra andre vev makrofager⁶. Microglia har en slektslinje som er forskjellig fra de fleste andre vev makrofager; de kolonisere CNS under en tidlig embryonale bølge av primitive hematopoiesis og selvstendig fornye gjennom livet, uavhengig av bidrag fra definitive hematopoiesis⁷. Fullt ut modne gene expression signatur voksen microglia oppnås ikke før den andre postnatal uke⁸. Miljømessige signaler fra de omkringliggende vev spiller en viktig rolle i dikterer vev-spesifikke macrophage funksjoner⁶, som i CNS inkluderer begrenset eksponering for blodbårne faktorer gitt av blod – hjerne barrieren⁹.

En helt forstå microglial bidrag til CNS homeostase og sykdom er vanskeligheten av recapitulating spesialiserte egenskapene for eldre microglia sett vivo med renset celler i vitro. Mange metoder har blitt utviklet for å isolere og kultur intakt microglia, men de fleste tilnærminger stole på serum støtte celle overlevelse. Vi har vist at tillegg av serum, som er en iboende variabel reagens som inneholder en rekke bioaktive molekyler, er særlig problematisk når arbeider med microglia fordi den fremmer en amoeboid morfologi, økt spredning, og økt fagocytose⁹ sett ofte i vivo når microglia er utsatt for blod båret faktorer etter avbrudd av blod – hjerne barrieren. Av disse beregningene, serum-eksponert cellene ligner microglia i skade eller sykdom stater, men slike endringer er redusert når microglia er kultivert i definerte vekstmediet som inneholder CSF-1 (eller IL-34), TGF-β, kolesterol og selenitt.

Denne protokollen gir detaljer for dyrking juvenile rotte microglia under serum-free forhold knyttet til nylig publiserte arbeider⁹. Denne protokollen er strømlinjeformet for rotter fra postnatal dag 21-30 (P21 – P30), men kan tilpasses å isolere microglia fra rotter og mus i alle aldre, om avkastning og totale levedyktighet vil variere avhengig av arter og alder på dyret. Maksimal gir og optimal levedyktighet oppnås ved litt umoden microglia (~ P9), gir og levedyktighet gradvis avsmalnende til noe lavere nivåer i voksen dyr. Microglia kan også være isolert fra mus, men vi har funnet at rotte celler Vis betydelig høyere avkastning levedyktighet og kompleksiteten i ramified morphologies, sammenlignet med musen celler i serum-free kulturer. Dyr alderen større enn P50 har ikke blitt evaluert med denne protokollen. Denne immunopanning isolasjon prosedyren er blitt optimert å minimere endringer i microglial transcriptional profiler under isolasjon og å maksimere nedstrøms levedyktigheten til cellene. Bruker disse teknikkene og media formuleringer, kan høy-levedyktigheten primære kulturer opprettholdes i uker. Microglia kultivert under disse forholdene viser en svært ramified morfologi med rask utvidelse og retraksjon av prosesser og lave relativt priser spredning. Vi understreke betydningen av serum-eksponering på disse egenskapene, og diskutere styrkene og svakhetene ved denne metoden i forhold til andre tilnærminger.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer gnagere likedannet Stanford University retningslinjer, som i samsvar med nasjonale og statlige lover og retningslinjer. Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Stanford University’s Administrative Panel på laboratoriet Animal Care. Merk: Alle løsning og buffer komposisjoner er gitt i Tabellen for materiale. 1. klargjør en Petriskål for CD11b Immunopanning (dag 0) Merk: Forberede 1 immunopannin…

Representative Results

Denne protokollen beskriver en metode å kultur høy renhetsgrad ramified microglia fra juvenile rotter. Lignende resultater kan oppnås ved hjelp av umodne, perinatal og voksen dyr, som beskrevet nedenfor. Siden cellen isolasjoner ofte inkluderer nyansene og mange muligheter for cellene å dø, brukte vi kvalitetskontroll sjekkpunkter for å finne suksess på trinnene. Vi vanligvis overvåket celle suspensjoner bruker en hemocytometer på flere trinn i isolasjon protokollen (<strong clas…

Discussion

Fordi microglia fungere som sentinel immunceller av CNS, er de svært responsive til miljøendringer; stor forsiktighet må derfor minimere inflammatorisk svar i cellene under deres isolasjon og kultur⁸. Dette gjøres i denne protokollen gjennom hastighets- og temperaturinnstillinger. Holde cellene på isen eller i 4 ° C når mulig reduserer aktivisering, så alle sentrifugering trinnene finner sted på 4 ° C, dyrene er parfyme med iskald perfusjon buffer, og protokollen har blitt strømlinjefor…

Materials

Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.