Isolamento e cultura de roedor Microglia para promover uma dinâmica ramificada morfologia em meio livre de soro

Summary

Esforços para entender a função microglial no detalhe tem sido prejudicados pela falta de modelos de cultura microglial que recapitular as propriedades de micróglia maduro na vivo . Este protocolo descreve uma abordagem de isolamento e cultura projetada para manter a sobrevivência robusta de rato maduro altamente ramificados microglia sob condições definidas e médias.

Abstract

Microglia representam 5-10% de todas as células do sistema nervoso central (SNC) e são cada vez mais atenção devido a suas contribuições durante o desenvolvimento, homeostase e doença. Embora os macrófagos têm sido estudados em detalhe por décadas, recursos especializados de micróglia, os macrófagos de tecido-residente do SNC, mantiveram-se em grande parte misteriosa, em parte devido às limitações na habilidade de recapitular microglial maduro Propriedades em cultura. Aqui, podemos ilustrar um procedimento simples para o isolamento rápido de puro microglia no cérebro de roedor maduro. Descrevemos também condições de cultura livre de soro que suportam níveis elevados de microglial viabilidade ao longo do tempo. Microglia cultivada sob essas condições definidas e médias apresentam elaborados processos ramificados e comportamento dinâmico de vigilância. Podemos ilustrar alguns efeitos de exposição de soro na microglia culta e discutir como essas culturas isento de soro comparam com culturas expostas ao soro, bem como micróglia em vivo.

Introduction

Como os macrófagos do parênquima CNS, microglia interagir com uma vasta gama de circuitos neuronais e gliais redes de sinalização. Eles desempenham um papel vital no desenvolvimento e na homeostase do cérebro através de poda sináptica, afastamento de célula apoptótica e transitórias interações com processos neuronais^1,2. Microglia são primeiros respondentes a lesões neurológicas, estendendo seus processos longos e finos para sites de lesão para coordenar as respostas inflamatórias e limitar o sangramento^3,4. Alterações na função e morfologia microglial são onipresentes em lesões de CNS agudas e crônicas, e microglia exposição alterou a expressão de mediadores inflamatórios em uma variada gama de Estados de doença¹, localização e morfologia. Estudos de genéticos humanos indicam que mutações que alteram o risco para doenças neurodegenerativas são frequentemente predominantemente ou exclusivamente expressa pela micróglia no SNC intacta, apontando para um papel crucial para microglia na patogênese da doença ou progressão⁵ . Dada sua proeminência em ferimentos e doenças, promover a compreensão da biologia microglial é uma alta prioridade para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas.

Muitos avanços importantes para a compreensão da biologia microglial surgiram extrapolando as técnicas e mecanismos descobertos em estudos de outras populações de macrófagos, incluindo métodos de cultura, perfis de expressão de gene e definições de funcional / morfológica dos Estados. Embora generalizada macrófago funções muitas vezes jogar em formas surpreendentes dentro da paisagem do CNS, microglia são eles próprios altamente especializado, exibindo uma morfologia ramificada e uma assinatura de expressão de gene único que os distingue de outros tecidos os macrófagos⁶. Microglia tem uma linhagem que é diferente da maioria dos outros macrófagos de tecido; Eles colonizam o CNS durante uma onda de embrionária precoce da hematopoiese primitivo e auto renovam ao longo da vida, independente de contribuições de hematopoiese definitivo⁷. A assinatura de expressão de gene totalmente maduro do adulto microglia não é alcançada até a segunda semana pós-parto⁸. Dicas ambientais no tecido circundante desempenham um papel importante em ditar o macrófago tecido-específica características⁶, que no SNC inclui limitada exposição a fatores transmitidas pelo sangue, concedido pelo barreira hemato – encefálica,⁹.

Um obstáculo para compreender plenamente microglial contribuições para a homeostase do CNS e doença é a dificuldade de sintetizando as propriedades especializadas do maduro microglia visto na vivo com células purificadas in vitro. Muitos métodos têm sido desenvolvidos para isolar e cultura microglia intacta, mas a maioria das abordagens dependem de soro para apoiar a sobrevivência da pilha. Mostramos que além de soro, que é um reagente inerentemente variável que contém uma vasta gama de moléculas bioativas, é especialmente problemática quando trabalhar com microglia porque promove uma morfologia ameboide, aumentou a proliferação, e aumento da fagocitose⁹ muitas vezes visto em vivo quando microglia são expostas ao sangue a cargo de fatores após o rompimento da barreira do sangue – cérebro. Por essas métricas, células expostas ao soro se assemelham a micróglia em lesões ou doenças, mas tais alterações são reduzidas quando microglia são cultivadas em meio de crescimento definidos contendo CSF-1 (ou IL-34), TGF-β, colesterol e Selenito.

Este protocolo fornece detalhes sobre cultivo microglia juvenil rato sob condições isento de soro, relacionadas com o trabalho recentemente publicado⁹. Este protocolo foi racionalizado para ratos de pós-Natal dia 21-30 (P21 – P30), mas pode ser adaptado para isolar microglia de ratos e camundongos, de qualquer idade, embora o rendimento e a viabilidade global irão variar dependendo da espécie e idade do animal. Máximo rendimento e viabilidade ideal é alcançada quando usando um pouco imaturo microglia (~ P9), com rendimentos e viabilidade gradualmente afilado, um pouco mais baixos níveis em animais adultos. Microglia também pode ser isolado de ratos, mas achamos que pilhas do rato mostram significativamente mais elevados rendimentos, viabilidade e complexidade de morfologias ramificadas, quando comparado com as pilhas do rato em culturas isento de soro. Animais com idade superior a P50 não foram avaliadas com este protocolo. Este procedimento de isolamento de immunopanning foi otimizado para minimizar as alterações nos perfis transcriptional microglial durante o isolamento e para maximizar a jusante viabilidade das células. Usando estas técnicas e formulações de mídia, alta-viabilidade culturas primárias podem ser sustentadas por semanas. Microglia cultivada sob essas condições apresentam uma morfologia altamente ramificada envolvendo rápida extensão e retração dos processos e relativamente baixas taxas de proliferação. Podemos destacar a importância do soro-exposição sobre essas propriedades e discutir os pontos fortes e fraquezas deste método em relação a outras abordagens.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo roedores em conformidade com as diretrizes da Universidade de Stanford, que estejam em conformidade com políticas e leis estaduais e nacional. Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo painel administrativo da Universidade de Stanford no cuidado do Animal de laboratório. Nota: Todas as composições de buffer e solução são fornecidas na Tabela de materiais. 1. preparar um prato de Petri para Immunopa…

Representative Results

Este protocolo descreve um método de cultura alta pureza ramificada microglia de ratos jovens. Resultados semelhantes podem ser obtidos usando animais imaturos, perinatais e adultos, como discutido abaixo. Desde que os isolamentos de célula frequentemente incluem nuances sutis e muitas oportunidades para as células a morrer, usamos pontos de verificação de controle de qualidade para ajudar a determinar o sucesso em várias etapas. Nós normalmente monitorados suspensões celulares us…

Discussion

Porque microglia servem como as células imunes Sentinela do SNC, eles são altamente sensíveis às mudanças ambientais; Portanto, muito cuidado é necessário para minimizar as respostas inflamatórias dentro das células durante seu isolamento e cultura⁸. Isso é feito no presente protocolo através de velocidade e temperatura. Sempre que possível reduz a ativação, para que todas as etapas de centrifugação ocorrem a 4 ° C, mantendo as células no gelo ou a 4 ° C, os animais são pintado…

Materials

Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.