Изоляции и культуры грызунов микроглии для поощрения динамичного разветвленная словотолкование в среде Serum-free

Summary

Усилия, чтобы понять микроглии функции подробно препятствовало отсутствие микроглии культуры моделей, которые пилки свойства зрелых в vivo микроглии. Этот протокол описывает изоляции и культуры подхода, призванного поддерживать надежные выживания микроглии весьма разветвленной зрелых крыс в условиях определенных средний.

Abstract

Микроглии представляют собой 5-10% от всех клеток центральной нервной системы (ЦНС) и все чаще обращают внимание из-за их вклад во время разработки, гомеостаза и болезни. Хотя макрофаги были изучены подробно на протяжении десятилетий, специализированные особенности микроглии, ткани резидентов макрофаги ЦНС, остаются во многом загадочный, отчасти из-за ограничений в способность резюмировать Зрелые микроглии свойства в культуре. Здесь мы иллюстрируем простой процедуры для быстрой изоляции чистого микроглии от зрелого грызун мозга. Мы также обсудим условия сыворотки свободной культуры, которые поддерживают высокий уровень жизнеспособности микроглии со временем. Микроглии, культивируемых в этих условиях определяется средний exhibit сложной разветвленной процессы и поведение динамического наблюдения. Мы иллюстрируют некоторые последствия воздействия сыворотки на искусственный микроглии и обсудить, как эти сыворотки свободной культуры по сравнению с сыворотка облученных культур, а также микроглии в естественных условиях.

Introduction

Как макрофаги паренхимы ЦНС микроглии взаимодействуют с огромным набором схем нейронов и глиальных сигнальной сети. Они играют жизненно важную роль в развитии и гомеостаза головного мозга через синаптических обрезки, Распродажа apoptotic клеток и переходных взаимодействия с нейрональные процессы^1,2. Микроглии являются раннего реагирования неврологических травм, расширяя их длинные, тонкие процессы для поражения сайтов для координации воспалительных реакций и ограничить кровотечение^3,4. Изменения в микроглии морфологии и функции являются вездесущими в острых и хронических травм ЦНС, и микроглии экспонат изменения морфологии, локализации и проявление воспалительных медиаторов в разнообразных заболеваний Штатов¹. Человеческие генетические исследования показывают, что мутации, которые изменяют риска для нейродегенеративные заболевания часто преимущественно или исключительно выражаются микроглии в неповрежденной ЦНС, указывая на важную роль для микроглии в патогенезе заболевания или прогрессирование⁵ . Учитывая их известность в травм и болезней, углубление понимания биологии микроглии является приоритетной для разработки новые терапевтические подходы.

Многие критические достижения понимания биологии микроглии возникли путем экстраполяции методы и механизмы, обнаружили в исследованиях других групп населения макрофагов, включая методы культуры, профили выражение гена и определения функциональных / Морфологические государств. Хотя обобщенные макрофагов, функции часто разыгрывают неожиданными способами в пределах ландшафта ЦНС, микроглии сами по себе являются узкоспециализированными, выставляют разветвленной морфологии и уникальный ген выражение подпись, которая отличает их от других тканей макрофаги⁶. Микроглии есть линия, которая отличается от большинства других тканевых макрофагов; они колонизировать ЦНС во время ранних эмбриональных волны примитивных кроветворения и самостоятельно обновить на протяжении всей жизни, независимо от взносов от окончательного кроветворения⁷. Полностью зрелые ген выражение подпись взрослого микроглии достигается не до второго послеродовой неделю⁸. Экологические сигналы от окружающих тканей играют важную роль в диктует макрофагов ткани специфических особенностей⁶, которая в ЦНС включает ограниченное воздействие факторов кровь, предоставленные blood – brain барьер⁹.

Одним из препятствий для полного понимания микроглии вклад ЦНС гомеостаза и болезней является сложность изложив специализированные свойства зрелых микроглии видели в vivo с очищенной ячейки в пробирке. Многие методы были разработаны для изоляции и культуру нетронутыми микроглии, но большинство подходов полагаться на сыворотке поддержать выживание клетки. Мы показали, что добавление сыворотки, которая по своей сути переменной реагента, содержит широкий спектр биологически активных молекул, особенно проблематичным, когда работа с микроглии потому, что он способствует Саркодовые морфологии, увеличение распространения, и увеличение фагоцитоза⁹ часто видели в естественных условиях , когда Микроглия подвергаются воздействию факторов кровь после нарушения blood – brain барьер. От этих показателей, сыворотка подвергается клетки напоминают травмы или заболевания государств микроглии, но такие изменения уменьшаются когда Микроглии являются культивировали в определенный рост среднего, содержащий РСУ-1 (или IL-34), TGF-β, холестерин и селенит.

Этот протокол обеспечивает детали для культивирования несовершеннолетних крыса микроглии сыворотки свободных условиях, связанных с недавно опубликованной работе⁹. Этот протокол упрощен для крыс от послеродового день 21-30 (P21 – P30), но может быть адаптирована к изолировать микроглии от крыс и мышей, любого возраста, хотя доходности и общей жизнеспособности будет варьироваться в зависимости от вида и возраста животного. Максимальная урожайность и оптимальной эффективности достигается при использовании немного незрелых микроглии (~ P9), урожайность и жизнеспособности, постепенно сужающийся к несколько более низкого уровня в взрослых животных. Микроглии также могут быть изолированы от мышей, но мы обнаружили, что клетки крыс показывают значительно выше урожайность, жизнеспособность и сложности разветвленной морфологии, когда по сравнению с клетки мыши в сыворотке бесплатно культур. Животных в возрасте более чем P50 не были оценены с настоящим Протоколом. Эта процедура изоляции immunopanning была оптимизирована для сведения к минимуму изменения в микроглии транскрипционный анализ профиля при изоляции и максимального течению жизнеспособность клеток. С помощью этих методов и средств массовой информации формулировок, высокой жизнеспособности первичных культур может быть устойчивым на недели. Микроглии, культивируемых в этих условиях проявляют весьма разветвленная Словотолкование, быстрое расширение и втягивание процессов и относительно низкие показатели распространения. Мы подчеркнуть значимость сыворотки воздействия на эти свойства и обсудить сильные и слабость этого метода по сравнению с другими подходами.

Protocol

Все процедуры с участием грызунов соответствует Стэнфордского университета руководящие принципы, которые соответствуют национальных и государственных законов и политики. Все животные процедуры были одобрены Стэнфордского университета административной панели на лабораторных живо?…

Representative Results

Этот протокол описывает метод для культуры высокой чистоты разветвленное микроглии от несовершеннолетних крыс. Аналогичные результаты можно получить с помощью незрелых, перинатальной и взрослых животных, как описано ниже. Поскольку ячейки изоляции часто включают в …

Discussion

Потому что микроглии служат дозорных иммунные клетки ЦНС, они являются очень реагировать на экологические изменения; Таким образом для сведения к минимуму воспалительных реакций в клетках во время их изоляции и культуры⁸требуется большой осторожностью. Это достигается в …

Materials

Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.