هنا نحن وصف العمليات الجراحية لإنتاج الهيميمقطع الجانبي للنخاع الشوكي (HX) موثوق بها على مستوىالصدر 9 في الفئران البالغة والتقييمات العصبية السلوكية المصممة للكشف عن العجز غير المتماثل بعد مثل هذه الإصابة من جانب واحد.
غالبًا ما تؤدي إصابة الحبل الشوكي غير المكتملة (SCI) إلى ضعف الوظائف الحسية الحركية وهي سريريًا النوع الأكثر شيوعًا من SCI. متلازمة براون-سكواريد البشرية هي نوع شائع من SCI غير المكتمل ة الناجمة عن آفة إلى نصف الحبل الشوكي مما يؤدي إلى الشلل وفقدان البروبيونية على نفس الجانب (أو ipsilesional) مثل الإصابة ، وفقدان الألم والإحساس بالحرارة على الجانب الآخر (أو العكس). المنهجيات الكافية لإنتاج تشريح الهيمي الجانبي للنخاع الشوكي (HX) وتقييم العاهات العصبية ضرورية لإنشاء نموذج الحيوان موثوق بها من متلازمة براون-سكوار. وعلى الرغم من أن نموذج قسم الهيميالجانبي يلعب دوراً محورياً في البحوث الأساسية والانتقالية، إلا أنه لا توجد بروتوكولات موحدة لإنشاء مثل هذا القسم الهيمي وتقييم الوظيفة الأحادية الجانب. الهدف من هذه الدراسة هو وصف الإجراءات خطوة بخطوة لإنتاج HX العمود الفقري الفئران في 9 thالصدر (T9) مستوى الفقرية. نحن ، ثم ، وصف مقياس السلوك المشترك لHX (CBS-HX) الذي يوفر تقييمًا بسيطًا وحساسًا للأداء العصبي غير المتماثل لـ SCI أحادي ة الجانب. وCBS-HX، التي تتراوح بين 0 إلى 18، ويتكون من 4 تقييمات الفردية التي تشمل يخطو الجانب الخلفي (UHS)، اقتران، وضع الاتصال، والمشي الشبكة. بالنسبة لـ CBS-HX ، يتم تقييم الأطراف الخلفية الأضلاع والجانبية بشكل منفصل. وجدنا أنه بعد T9 HX ، أظهر الطرف الخلفي ipsilateral ضعف وظيفة السلوك في حين أن الجانب الخلفي المقابل أظهر انتعاشًا كبيرًا. وCBS-HX تميز بشكل فعال الوظائف السلوكية بين الأطراف الخلفية ipsilateral وكونتابية وكشف التقدم الزمني للانتعاش من الجانب الخلفي ipsilateral. يمكن تحليل مكونات CBS-HX بشكل منفصل أو بالاشتراك مع تدابير أخرى عند الحاجة. على الرغم من أننا قدمنا فقط أوصافًا بصرية للإجراءات الجراحية والتقييمات السلوكية لـ HX الصدري ، إلا أنه يمكن تطبيق المبدأ على SCIs غير مكتملة أخرى وعلى مستويات أخرى من الإصابة.
غالبًا ما تؤدي إصابات الحبل الشوكي غير المكتملة (SCI) إلى ضعف شديد ومستمر في الوظائف الحسية الحركية وهي سريريًا النوع الأكثر شيوعًا من SCI1. تسبب متلازمة براون-سيكوارد في البشر عن طريق آفة لنصف الحبل الشوكي مما يؤدي إلى الشلل وفقدان البروبيونعلى نفس الجانب (أو ipsilesional) مثل الإصابة ، وفقدان الألم والإحساس بالحرارة على الجانب الآخر (أو contralesional)2،3،4. وتستخدم نماذج الحيوانات العمود الفقري الهيمي مقطع ابهي على نطاق واسع لتقليد الإنسان براون-Séquard متلازمة وأنها قد ذكرت في الفئران5,,6,,7,,8,9,opossums10,والقرود87,,11,,12,,13 من قبل مختبرات مختلفة في مختلف مستويات العمود الفقري. ومع ذلك، لم يتم وصف الإجراءات التفصيلية التفصيلية التفصيلية لإنتاج قسم الهيمي الجانبي القياسي. ومن شأن توفير إجراءات تدريجية لقسم الهيمي الجانبي أن يحسن النموذج وييسر مقارنة النتائج التجريبية أو تكرارها في البحوث الأساسية والانتقالية.
وينتج عن نظام SCI الأحادي الجانب عجز سلوكي غير متماثل وغير متناسب يصعب قياسه باستخدام التقييمات التقليدية للإصابات المتماثلة. والمنهجية الملائمة لتقييم العاهات العصبية لاستراتيجية الكفاءة الاستراتيجية من جانب واحد عنصر أساسي في وضع نموذج انفرادي للتقييم الذاتي للأمراض. على الرغم من الدور المحوري لإصابة العمود الفقري من جانب واحد ، تفتقر إلى بروتوكولات موحدة لتقييم العجز الحسي الحركي في الحيوانات التي تعاني من مثل هذه الإصابة. كان مقياس تصنيف locomotor Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) هو القياس الأكثر استخدامًا للوظيفة بعد SCI للفئران البالغة 14 مما ينتج وصفًا شبه كمي للحركة ككل. ومع ذلك، فإنه لا يقيس كل طرف خلفي بشكل مستقل.
في هذه الدراسة، نبلغ عن إجراءات خطوة بخطوة لإنتاج HX العمود الفقري القوارض في 9th الصدر (T9) مستوى الفقرية. كما نقدم مقياس سلوك مشترك لقسم الهيمي (CBS-HX) يتضمن خطوة من جانب واحد في الجانب الخلفي (UHS) ، والاقتران ، ووضع الاتصال ، وتقييمات المشي الشبكية لتقييم الإعاقات العصبية والانتعاش بعد SCI أحادية الجانب. نأمل أن يكون هذا النموذج نموذجا مفيدا لدراسة آليات الإصابة والفعالية العلاجية لSCIs من جانب واحد.
في هذه الدراسة، نبلغ عن إجراءات خطوة بخطوة لإنتاج بسيطة ومتسقة وقابلة للاستنساخ T9 العمود الفقري HX في الفئران الكبار التي تحاكي متلازمة براون-سيكوند في البشر. كما نقدم نظام نقاط السلوك المشترك لقسم الهيمي (CBS-HX) وهو حساس لتقييم ضعف عصبي غير متماثل وتطور الانتعاش ، يقاس بمزيج من يخطو من جانب واحد في الطرف الخلفي (UHS) ، اقتران (CPL) ، وضع الاتصال ، والشبكة المشي. على الرغم من أننا نظهر الإصابة على مستوى T9، يمكن تطبيق هذا الإجراء على مناطق أخرى من الحبل الشوكي بما في ذلك الحبل العنقي والقطني بطريقة بسيطة وغير متطلبة. نأمل أن يكون هذا النموذج ، إلى جانب التقييمات السلوكية أحادية الجانب ، مفيدًا لدراسة آليات الإصابة والفعالية العلاجية لمثل هذه الأنواع من SCI.
نظرًا لأن نموذج HX الجانبي لا يُشأ سوى النصف ipsilateral من الحبل ، يتم الحفاظ على الجانب المقابل للسلك إلى حد كبير ويمكن استخدامه كتحكم داخلي. يتم إسقاط العديد من المسارات التنازلية والتصاعدية من جانب واحد وينتج عن تشريح الهيمي الجانبي في كثير من الظروف ضرر ًا للمسار المحوري في جانب واحد ويحافظ على نفس المسار على الجانب الآخر ، مما يسمح بمقارنة إعادة التنظيم و عواقب وظيفية لهذه المسالك في نفس الحيوان. بالإضافة إلى ذلك ، قد يسمح إنتاج آفة أكثر محلية باستهداف مسارات محددة. على سبيل المثال، قد تؤثر الآفة البطنية والفيترية على المسارات الشبكية النخاعية والدهليزية. قد تؤثر الآفة الظهرية أو الظهرية على مسارات الكورتيكوستيالشوكي والرباالشوكي. ويمكن أيضا أن تستخدم في قسم الهيمي أو نموذج الإصابة الجزئية لدراسة التشريح وظيفة مسارات أخرى, مثل البروبيونفيل, noradrenergic أو مسارات السيروتونين. وهكذا، يمكن استخدام نموذج قسم الهيمي بشكل فريد لدراسة التعويض عن طريق afferents الحسية، من خلال مسارات تنازلية، والدوائر الشوكية الجوهرية. هذا النموذج هو أيضا مناسبة للتحقيق آليات الانتعاش الحركي بعد HX.
يؤدي HX الجانبي إلى عاهات سلوكية واضحة ، والتي يمكن تقييمها تحت المهام الحركية (على سبيل المثال ، Treadscan أو Treadmill) نموذج لتحليل المشي الآلي 19. أيضا ، يمكن قياس الموصلية للمساحات المحورية على الجانب المقابل للآفة باستخدام التسجيلات الكهروفيزيولوجية ، ويوفر هذا التقييم إمكانية إنشاء إعادة تنظيم وظيفية بعد علاجات مختلفة. وعلاوة على ذلك، الحقن من جانب واحد من التتبع التشريحي في الخلايا العصبية من مسار معين تسمح التصور من ألياف عبور خط الوسط المسمى anterogradely واتصالها مع الخلايا العصبية المسمى بأثر رجعي20،21،22،23،24،25.
على الرغم من أن جراحة HX النموذجية في العمود الفقري تستغرق أقل من 20 دقيقة للانتهاء، إلا أنها تتطلب بعض الممارسة لتحقيق HX دقيق ومتسق. أولاً، من المهم أن يكون مستوى HX الشوكي متسقًا من الحيوان إلى الحيوان. لذلك ، من الأهمية بمكان تحديد الجزء الفقري المناسب لاستئصال اللامينكوت. ثانياً، تأكد من اكتمال HX. لجعل HX كاملة، يمكن للمرء استخدام إبرة 30 قياس إدراجها عموديا من خلال خط الوسط لتوجيه القطع باستخدام microscissors. كما يتجنب إدخال الإبرة تلف الأوعية الشوكية الخلفية أو الحبل النخاعي بسبب التشوه. الوظيفة الثانية للإبرة 30 قياس هو أنه يمكن أن تكون بمثابة سكين لتتبع قطع للتأكد من أنه لا يوجد أي غموض في الآفة. ثالثا، وضع الجيلاتين على موقع الآفة يمكن أن تقلل من تسرب السائل النخاعي، ووضع الأسمنت على رأس الجيلاتين وسد الصفيحة الفقرية يمكن أن تعزز استقرار الفقرات الشوكية في موقع الآفة وتسهيل التئام الجروح. لتجنب تداخل الإشارة مع تطبيق التسجيلات الكهروفسية ، يجب خياطة العضلات واللفافة والجلد في طبقات مع خيط حرير 4-0. وأخيرا، ينبغي بذل كل جهد ممكن للحد من الأضرار التي لحقت الحبل الشوكي كونتربين. يجب إنشاء التحقق النسيجي لتأكيد قسم الهيميالجانبي الكامل على جانب واحد والحفاظ على النصف الآخر من الحبل على الجانب الآخر (كما هو موضح في الشكل 6E).
لتحسين الحركة بعد SCI ، استخدمت الدراسات السابقة مجموعة واسعة من الاستراتيجيات بما في ذلك زرع الخلايا ، وتجديد محور عصبي 8،18،26 ،27،27وإعادة التأهيل القائم على النشاط 28،29،30. وفي الوقت نفسه، تم إنشاء العديد من الاختبارات السلوكية للتقييم الوظيفي وفحص أفضل العلاجات بعد SCI. تم تصميم مقياس تصنيف اللوكورموتور BBB لتقييم locomotor للإصابات المتناظرة في العمود الفقري مثل كدمة خط الوسط أو إصابات استئصال الغيبوبة التي تؤثر على الأطراف الخلفية الثنائية 14،31. يتم تسجيل بعض معلمات BBB، مثل التنسيق وإزالة الأرجل، من خلال مراقبة كلا الطرفين الخلفيين. إذا كان أحد الأطراف الخلفية سليمًا ويظهر الآخر العجز كما رأينا في الإصابات غير المتماثلة ، فإن الطرف الخلفي السليم سيربك درجة الطرف الخلفي المصاب. وبما أن تسجيل BBB لا يستوعب درجة واحدة من الطرف الخلفي من الأخرى بعد الإصابة الأحادية الجانب ، فإنه ليس مثاليًا لتقييم إصابات الحبل الشوكي الأحادية الجانب. ومع ذلك ، إذا تم تقييم الحركة المشتركة ودعم الوزن على كل جانب بشكل منفصل ولا يتم حسابها كجزء من BBB ، فإن الطرف الخلفي السليم (على غرار عنصر التحكم الصوري) لن يحرف درجة الطرف الخلفي المصاب. وعلاوة على ذلك، فإن الجانب السليم لا التحيز النتيجة الإجمالية للالحيوان، لأن الجانب الخلفي سليمة لا يوجد لديه عجز كبير في حركة مشتركة، ودعم الوزن، أو يخطو.
تم تصميم درجة السلوك المجمعة لقسم الهيمي أن تكون تقييمًا حساسًا وسهل الأداء للانتعاش السلوكي في نموذج الفئران للتشريح الهيمي الجانبي. ويمكن استخدامه لتقييم السلوكيات في كل من المراحل المبكرة والمتأخرة من الانتعاش. المرحلة المبكرة في غضون 7-10 أيام بعد الإصابة. في الأيام 3-5 الأولى بعد HX، زاد نشاط الأطراف الخلفية ipsilateral باطراد وينبغي تقييمها بشكل أكثر تواترا لتسجيل عمليات استرداد حركة الأطراف الخلفية العفوية أو بوساطة العلاج. قبل 5-7 أيام بعد HX، بدأت الفئران لجعل الحركات الخلفية كاسحة دون دعم الوزن. بحلول 7-10 أيام، بدأت الفئران عادة في الوقوف والخطوة. وخلال هذه المرحلة، ينبغي إيلاء الاهتمام لنمط الانطلاق. في المرحلة المتأخرة (14-28 يومًا) ، كان نشاط الأطراف الخلفية ipsilateral مستقرًا وقريبًا من الوضع الطبيعي.
وينبغي أيضا إيلاء اهتمام وثيق لقدرة الاقتران. يمكن إجراء اختبار CPL (اقتران المشية) إما مع فيديو (على سبيل المثال، Treadscan /Catwalk) أو فيديو تصوير أثناء اختبار مفتوح المجال. الخيار الثاني يوفر المرونة إذا لم يكن لدى الباحثين إمكانية الوصول إلى نظام تحليل المشي. بالنسبة لجلسات تسجيل الفيديو، يلزم إجراء هبوطين متتاليين على الأقل لكل قدم لهذا الاختبار. للتحليل، هناك ثلاثة معلمات اقتران: اقتران متجانس ومتجانس وقطري (الخطوة 6.2). كل اقتران ينطوي على القدم المرجعية والقدم المعطى. اتخاذ اقتران متجانسة (الجبهة اليسرى الأمامية اليمين، أو اليمين الأيسر الخلفي الخلفي) على سبيل المثال، هو أول وقت هبوط من قدم معينة مقسومة على واحد وقت خطوة كاملة من القدم المرجعية. منذ القدم اليسرى واليمنى ينبغي أن يكون خارج المرحلة، وينبغي أن يكون اقتران الكمال 0.5. هذه هي الحالة نفسها في اقتران التماثلي (يمين اليسار الأيسر الخلفي، أو اليمين الأيمن الخلفي). ومع ذلك ، للاقتران القطري (يمين اليسار الخلفي ، أو اليمين الأمامي الأيسر الخلفي) ، يجب أن يكون الاقتران المثالي 0 أو 1 لأن القدمين يجب أن تكون في المرحلة. في الخطوة 6.4، نقوم بتعيين درجة لكل CPL من 0 إلى 2. في التفاصيل، يجب أن تمثل درجة 0 القدم المعطاة غير قادر على التحرك لإنهاء هبوط، وبالتالي لا CPL. درجة 1 يمثل أي CPL غير النظامية أو الخرقاء منذ القدم المعطاة ينتهي هبوط ولكن ليس في اقتران الكمال؛ درجة 2 يعني اقتران مثالي من 0.5. يتم وصف مفاهيم المعلمة الثلاثة في المنشورات السابقة32،33. يمكن الجمع بين CPL مع تقييمات وضع الاتصال والمشي عبر الشبكة. المكونات الفردية لنظام تسجيل السلوك مجتمعة ستكون أكثر أو أقل فعالية في نماذج الفئران المختلفة من SCI. بالنسبة لـ CPL ، أصبح العجز واضحًا في معدل التناوب واكتمال التسلسل. يمكن الكشف بوضوح عن العجز في وضع البوائد السفلي ة بعد HX من جانب واحد. في دراستنا، أظهرت جميع الفئران العجز وضع inlimb inlimb inlimb في حين أن وضع الجانب الخلفي كونترال يظهر أي عجز. يجب النظر في اختبار المشي الشبكة عند وضع الاتصال، الذي ينطوي على القناة القشرية، ويبدأ في التعافي. لاستبعاد أي مشاكل التعب المحتملة، يمكن أن يكون تسلسل الاختبارات السلوكية عشوائية في كل اختبار.
في الختام، ونحن تقرير الإجراءات خطوة بخطوة لخلق نموذج استنساخفي الفئران الحي من HX العمود الفقري T9 الذي يحاكي متلازمة براون-سيكوند في البشر. يوفر نظام تسجيل السلوك المشترك لقسم الهيمي القسم مقياسًا أكثر تمييزًا للنتائج السلوكية الفردية الخلفية لتقييم آليات الإصابات والعلاجات بعد SCI أحادي ة الجانب. على الرغم من أننا نقدم فقط وصفا بصريا للعمليات الجراحية والتقييمات السلوكية لHX الصدر، ويمكن تطبيق الأساليب الموصوفة هنا إلى SCIs أخرى غير مكتملة على مستويات مختلفة من الإصابة.
The authors have nothing to disclose.
ونشكر السيد جيفري ريتشيا – رايف على مساعدته التقنية الممتازة. وقد تم دعم هذا العمل جزئياً من قبل مؤسسة مدير المستشفى العام في منطقة جينان العسكرية في شينز PLA 2016ZD03 و 2014ZX01 (XJL و TBZ). يتم دعم الأبحاث في مختبر Xu من قبل NIH 1R01 100531، 1R01 NS103481، وجائزة مراجعة الجدارة I01 BX002356، I01 BX003705، I01 RX002687 من وزارة شؤون المحاربين القدامى في الولايات المتحدة.
Baby-Mixter Hemostat | FST | 13013-14 | Can be any brand of choice |
Elevated plastic coated wire mesh grid | Any | 36×38 cm with 3 cm2 openings | |
Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. |
Microbead Sterilizer | FST | NA | Can be any brand of choice |
Pearson Rongeur | FST | 16015-17 | Can be any brand of choice. |
Retractors | Jinxie surgical tools | 6810 | Can be any brand of choice |
Scalpel Handle | FST | 10003-12 | Can be any brand of choice |
Simplex-P cement | Stryker | Can be any brand of choice. | |
TreadScan automatic gait analysis | CleverSys Inc | NA | Can be any brand of choice |