Her beskriver vi kirurgiske procedurer til at producere en pålidelig rygmarvlateral hemisektion (HX) på 9th thorax niveau hos voksne rotter og neurobehavioral vurderinger designet til at opdage asymmetriske underskud efter en sådan ensidig skade.
Ufuldstændig rygmarvsskade (SCI) fører ofte til funktionsnedsættelser af sensoriske funktioner og er klinisk den hyppigste type SCI. Human Brown-Séquard syndrom er en almindelig form for ufuldstændig SCI forårsaget af en læsion til den ene halvdel af rygmarven, hvilket resulterer i lammelse og tab af proprioception på samme (eller ipsilesional) side som skaden, og tab af smerte og temperatur fornemmelse på den modsatte (eller kontralæsonale) side. Tilstrækkelige metoder til fremstilling af en lateral hemisektion i rygmarven (HX) og vurdering af neurologiske funktionsnedsættelser er afgørende for at etablere en pålidelig dyremodel af Brun-Séquardsyndrom. Selv om lateral hemisektion model spiller en central rolle i grundlæggende og translationel forskning, standardiserede protokoller for at skabe en sådan hemisection og vurdere unilateraliseret funktion mangler. Målet med denne undersøgelse er at beskrive trin-for-trin procedurer til at producere en rotte spinal lateral HX på 9th thorax (T9) vertebrale niveau. Vi beskriver derfor en kombineret adfærdsskala for HX (CBS-HX), der giver en enkel og følsom vurdering af asymmetrisk neurologisk ydeevne for ensidig SCI. CBS-HX, der spænder fra 0 til 18, består af 4 individuelle vurderinger, som omfatter ensidig bagbensstepping (UHS), kobling, kontaktplacering og grid walking. For CBS-HX vurderes de ipsilaterale og kontralaterale bagben separat. Vi fandt, at efter en T9 HX, den ipsilaterale baglemmen viste nedsat adfærd funktion mens den kontralaterale baglemme viste betydelig bedring. CBS-HX diskriminerede effektivt adfærdsfunktioner mellem ipsilaterale og kontralaterale bagben og påviste tidsmæssig progression af inddrivelsen af det ipsilaterale bagben. CBS-HX komponenterkan analyseres separat eller i kombination med andre foranstaltninger, når det er nødvendigt. Selv om vi kun gav visuelle beskrivelser af de kirurgiske procedurer og adfærdsmæssige vurderinger af en thorax HX, princippet kan anvendes på andre ufuldstændige SCIs og på andre niveauer af skaden.
De ufuldstændige rygmarvsskader (SCI) fører ofte til alvorlige og vedvarende funktionsnedsættelser af sensoriske funktioner og er klinisk den hyppigste type SCI1. Brown-Séquard syndrom hos mennesker er forårsaget af en læsion til halvdelen af rygmarven, som resulterer i lammelse og tab af proprioception på samme (eller ipsilesional) side som skaden, og tab af smerte og temperatur fornemmelse på den modsatte (eller kontralæsonale) side2,3,4. Spinal lateral hemisektion dyremodeller bruges bredt til at efterligne humant Brown-Séquard syndrom, og de er blevet rapporteret i rotter5,,6,,7,8,9, opossums10, og aber7,11,12,13 af forskellige laboratorier på forskellige spinal niveauer. Der er imidlertid ikke beskrevet detaljerede visualiserede procedurer for fremstilling af en standardsidehemisektion. Ved at tilvejebringe trinvise procedurer for en lateral hemisektion bør modellen optimeres, og eksperimentelle resultater kan sammenlignes eller replikeres i grundforskning og translationel forskning.
En ensidig SCI producerer asymmetriske og disproportional adfærd underskud, der er vanskelige at måle ved hjælp af konventionelle vurderinger for symmetriske skader. En passende metode til vurdering af neurologiske funktionsnedsættelser for en ensidig SCI er et væsentligt element i udviklingen af en ensidig SCI-model. På trods af den centrale rolle, som en ensidig rygmarvsskade spiller, mangler der standardiserede protokoller til vurdering af sensoriske underskud hos dyr med en sådan skade. Den Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) bevægelsesgrad har været den hyppigst anvendte måling af funktion efter SCI for voksne rotter 14, som giver en semikvantitativ beskrivelse af bevægelse som helhed. Men det måler ikke hver bagdel uafhængigt.
I denne undersøgelse rapporterer vi trin-for-trin procedurer til at producere en gnaver spinal HX på 9th thorax (T9) vertebrale niveau. Vi introducerer også en kombineret adfærdsskala for hemisektion (CBS-HX), der omfatter ensidig bagbensstepping (UHS), kobling, kontakt og gittergangsvurderinger til evaluering af neurologiske funktionsnedsættelser og restitution efter en ensidig SCI. Vi håber, at denne model vil være en nyttig model til undersøgelse af skadesmekanismer og terapeutiske effektivitet for ensidige SCI’er.
I denne undersøgelse rapporterer vi trin-for-trin procedurer for at producere en enkel, konsekvent og reproducerbar T9 spinal HX hos voksne rotter, der efterligner Brown-Séquard syndrom hos mennesker. Vi introducerer yderligere et kombineret adfærdsscoresystem for hemisektion (CBS-HX), som er følsomt over for at evaluere asymmetrisk neurologisk svækkelse og progression af genvinding, målt ved en kombination af ensidig bagbensstepping (UHS), kobling (CPL), placere kontakt, og gitter gang. Selv om vi påviser skaden på T9-niveau, kan denne procedure anvendes på andre områder af rygmarven, herunder livmoderhalskræft og lændesnoren på en enkel og fordringskrævende måde. Vi håber, at denne model, sammen med unilateraliserede adfærdsmæssige vurderinger, vil være nyttig til at undersøge skade mekanismer og terapeutiske effektivitet for sådanne typer af SCI.
Da den laterale HX-model kun læsioner den ipsilaterale halvdel af ledningen, den kontralaterale side af ledningen er stort set bevaret og kan bruges som en intern kontrol. Mange faldende og stigende veje er ensidigt projiceret og en lateral hemisektion i mange tilfælde producerer skader på en axonal tarmkanalen på den ene side og bevarer den samme tarmkanalen på den modsatte side, så sammenligning af reorganisering og funktionelle konsekvenser af disse skrifter i samme dyr. Desuden, producerer en mere lokaliseret læsion kan tillade målretning af specifikke veje. For eksempel, en ventral og ventrolateral læsion kan påvirke reticulospinal og vestibulospinal veje. En dorsal eller dorsolateral læsion kan påvirke kortikospinal og rubrospinal veje. Den hemisektion eller delvis skade model kan også bruges til at studere anatomi og funktion af andre veje, såsom propriospinal, noradrenerge eller serotonerge veje. Således kan hemisection model være entydigt ansat til at studere kompensation ved sensoriske afferents, ved faldende veje, og ved iboende spinal kredsløb. Denne model er også velegnet til at undersøge mekanismer til lokomotor opsving efter HX.
Den laterale HX fører til indlysende adfærdsmæssige funktionsnedsættelser, som kan vurderes under motoriske opgaver (f.eks Treadscan eller Løbebånd) paradigme for den automatiserede gangart analyse 19. Desuden kan ledningsevne axonale skrifter på den kontralaterale side til læsionen måles ved hjælp af elektrofysiologiske optagelser, og denne evaluering giver mulighed for at etablere en funktionel reorganisering efter forskellige behandlinger. Desuden tillader ensidige injektioner af de anatomiske sporstoffer i neuroner af en bestemt vej visualisering af anterogradely mærket midterlinjen krydser fibre og deres forbindelse med retrogradly mærket neuroner20,21,22,23,24,25.
Selv om en typisk spinal HX operation tager mindre end 20 minutter at afslutte, det kræver en vis praksis at opnå en præcis og konsekvent HX. For det første er det vigtigt, at spinal HX niveau være konsekvent fra dyr til dyr. Det er derfor afgørende, at det relevante vertebrale segment for laminektomi identificeres. For det andet skal du sørge for, at HX er færdig. For at lave en komplet HX, kan man bruge en 30-gauge nål indsat lodret gennem midterlinjen til at guide skæring ved hjælp af mikrosaks. Nålen indsættelse også undgår skader på de bageste spinal fartøjer eller ledningen over læsion. Den anden funktion af 30-gauge nålen er, at det kan tjene som en kniv til at spore snittet for at sikre, at der ikke er nogen tvetydighed af læsionen. For det tredje, placere gelatine på læsionsstedet kan minimere cerebrospinalvæske lækage, og placere cement på toppen af gelatine og bygge bro vertebrale lamina kan styrke stabiliteten af ryghvirvler på læsionsstedet og lette sårheling. For at undgå signalinterferens med anvendelsen af elektrofysiologiske optagelser, skal muskler, fascia og hud sutureres i lag med 4-0 silketråd. Endelig bør der gøres alt for at minimere skaderne på den kontralaterale rygmarv. Der bør foretages histologisk verifikation for at bekræfte en fuldstændig tværgående hemisektion på den ene side og bevarelse af den anden halvdel af ledningen på den anden side (som vist i figur 6E).
For at forbedre bevægelse efter SCI har tidligere undersøgelser anvendt en lang række strategier, herunder celletransplantation, axonregenerering 8,18,26,27og aktivitetsbaseret rehabilitering 28,29,30. I mellemtiden er flere adfærdsmæssige tests blevet etableret for funktionel vurdering og til at screene for de bedste behandlinger efter SCI. BBB-bevægelsesskalaen er designet til bevægelsesvurdering af rygsymmetriske skader såsom en mellemlinjekontusion eller transsektionsskader , der påvirker de bilaterale bagben 14,31. Visse parametre for BBB, såsom koordination og tårydning, registreres ved at observere begge bagben. Hvis den ene bagdel er intakt, og den anden viser underskud som set i asymmetriske skader, så den intakte bagben vil forvirre score af de berørte baglem. Da BBB-scoringen ikke kan rumme den ene bagbensscore fra den anden efter den ensidige skade, er den ikke ideel til at vurdere ensidige rygmarvsskader. Men hvis fælles bevægelse og vægt støtte på hver side vurderes separat og ikke beregnes som en del af BBB, så intakt baglem (svarende til en fingeret kontrol) vil ikke forvirre score af de berørte baglem. Desuden vil den intakte side ikke bias den samlede score af dyret, fordi den intakte bagben ikke har dramatiske underskud i fælles bevægelse, vægtstøtte, eller stepping.
Den kombinerede adfærd score for hemisection er designet til at være en følsom og let udføres evaluering af adfærdsmæssige opsving i rotte model af lateral hemisection. Det kan bruges til at vurdere adfærd af både tidlige og sene faser af inddrivelse. Den tidlige fase er inden for 7-10 dage efter skade. I de første 3-5 dage efter HX steg den ipsilaterale hindlimb-aktivitet støt og bør vurderes hyppigere for at registrere spontane eller behandlingsmedierede bagbensbevægelses genindvindinger. Ved 5-7 dage efter HX, rotter begyndte at gøre fejende bagben bevægelser uden vægtstøtte. Ved 7-10 dage, rotter typisk begyndte at stå og skridt. I denne fase bør der lægges vægt på stepping mønster. I den sene fase (14-28 dage) var den ipsilaterale hindlimb-aktivitet stabil og tæt på normal.
Der bør også lægges stor vægt på koblingskapacitet (CPL). CPL-testen (gangkobling) kan udføres enten med en video (f.eks. Den anden mulighed giver fleksibilitet, hvis forskerne ikke har adgang til ganganalysesystemet. For begge videooptagelsessessioner kræves der mindst to touchdowns i træk for hver fod til denne test. Til analysen er der tre koblingsparametre: homolog, homolateral og diagonal kobling (trin 6.2). Hver kobling indebærer en referencefod og den givne fod. Tag homolog kobling (forreste venstre-forreste højre, eller bagvenstre-bagtil højre) for eksempel, det er den første touchdown tid af den givne fod divideret med en hel skridttid af referencefoden. Da venstre og højre fod skal være ude af fase, skal den perfekte kobling være 0,5. Dette er det samme tilfælde i homolateral kobling (venstre forreste venstre bagdel, eller højre forreste højre bagdel). For diagonalkobling (venstre forhøjrebagehøjrebag, eller højre forreste venstre bagdel), skal den perfekte kobling dog være 0 eller 1, da de to fødder skal være i fase. I trin 6.4 tildeler vi en score for hver CPL fra 0 til 2. I detaljer skal en score 0 repræsentere den givne fod ikke er i stand til at bevæge sig for at afslutte en touchdown, og dermed ingen CPL; en score 1 repræsenterer enhver uregelmæssig eller klodset CPL, da den givne fod afslutter et touchdown, men ikke i den perfekte kobling en score 2 betyder en perfekt kobling på 0,5. De tre koblingsparameterkoncepter er godt beskrevet i de foregående publikationer32,33. CPL kan kombineres med vurderinger af kontakt placering og gitter gang. Individuelle komponenter i den kombinerede adfærd scoring system vil være mere eller mindre effektiv i forskellige rotte modeller af SCI. For CPL blev underskuddene naturligvis synlige i vekslens hastighed og sekvensens fuldstændighed. Proprioceptive bagben placere underskud kunne tydeligt afsløres efter ensidig HX. I vores undersøgelse, alle rotter viste ipsilesional hindlimb placere underskud, mens den kontralaterale baglemme placering viste ingen underskud. Gitteret walking test bør overvejes, når kontakt placering, som involverer kortikospinal tarmkanalen, begynder at komme sig. For at udelukke eventuelle træthed spørgsmål, rækkefølgen af adfærdsmæssige tests kunne randomiseres ved hver test.
Afslutningsvis rapporterer vi trin-for-trin procedurer for at skabe en reproducerbar in vivo rotte model af T9 spinal HX, der efterligner Brown-Séquard syndrom hos mennesker. Den kombinerede adfærd scoring system for hemisection tilbyder en mere diskriminerende foranstaltning af de enkelte baglemadfærdsmæssige resultater for evaluering af skade mekanismer og behandlinger efter en ensidig SCI. Selv om vi kun giver en visuel beskrivelse af de kirurgiske procedurer og adfærdsmæssige vurderinger af en thorax HX, metoder, der er beskrevet her kan anvendes på andre ufuldstændige SCIs på forskellige skadeniveauer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jeffrey Recchia-Rife for hans fremragende tekniske bistand. Dette arbejde blev delvist støttet af instituttet for generaldirektør hospital i Jinan militærregion Chines PLA 2016ZD03 og 2014ZX01 (XJL og TBZ). Forskning i Xu laboratoriet understøttes af NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481, og Merit Review Award I01 BX002356, I01 BX003705, I01 RX002687 fra u.S. Department of Veterans Affairs.
Baby-Mixter Hemostat | FST | 13013-14 | Can be any brand of choice |
Elevated plastic coated wire mesh grid | Any | 36×38 cm with 3 cm2 openings | |
Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. |
Microbead Sterilizer | FST | NA | Can be any brand of choice |
Pearson Rongeur | FST | 16015-17 | Can be any brand of choice. |
Retractors | Jinxie surgical tools | 6810 | Can be any brand of choice |
Scalpel Handle | FST | 10003-12 | Can be any brand of choice |
Simplex-P cement | Stryker | Can be any brand of choice. | |
TreadScan automatic gait analysis | CleverSys Inc | NA | Can be any brand of choice |