Ici nous décrivons des procédures chirurgicales pour produire une hémisection latérale fiable de moelle épinière (HX) au niveau thoracique de 9e dans les rats adultes et évaluations neurocomportementales conçues pour détecter des déficits asymétriques après une telle blessure unilatérale.
Les lésions incomplètes de moelle épinière (SCI) mènent souvent à des affaiblissements des fonctions sensorimotor et sont médicalement le type le plus fréquent de SCI. Le syndrome humain de Brown-Séquard est un type commun de SCI incomplet provoqué par une lésion à la moitié de la moelle épinière qui a comme conséquence la paralysie et la perte de proprioception sur le même côté (ou ipsilesional) que la blessure, et la perte de douleur et de sensation de température sur le côté opposé (ou contralesional). Des méthodologies adéquates pour produire une hémisection latérale de moelle épinière (HX) et évaluer des affaiblissements neurologiques sont essentielles pour établir un modèle animal fiable du syndrome de Brown-Séquard. Bien que le modèle d’hémisection latérale joue un rôle central dans la recherche fondamentale et translationnelle, les protocoles normalisés pour créer une telle hémisection et évaluer la fonction unilatéralisée font défaut. Le but de cette étude est de décrire les procédures étape par étape pour produire un HX latéral spinal de rat au niveau9e thoracique (T9) vertébral. Nous décrivons donc une échelle de comportement combinée pour HX (CBS-HX) qui fournit une évaluation simple et sensible des performances neurologiques asymétriques pour SCI unilatérale. Le CBS-HX, allant de 0 à 18, est composé de 4 évaluations individuelles qui comprennent le pas de l’arrière unilatéral (UHS), le couplage, le placement de contact et la marche sur la grille. Pour CBS-HX, les arrière-lignes ipsilateral et contralatérales sont évaluées séparément. Nous avons constaté que, après un T9 HX, le rétrolimb ipsilateral a montré la fonction altérée de comportement tandis que l’arrière contralatéral a montré la récupération substantielle. Le CBS-HX a effectivement discriminé les fonctions comportementales entre les arrière-derniers ipsilateral et contralatéral et la progression temporelle détectée de la récupération de l’arrière-train ipsilateral. Les composants CBS-HX peuvent être analysés séparément ou en combinaison avec d’autres mesures au besoin. Bien que nous ayons seulement fourni des descriptions visuelles des procédures chirurgicales et des évaluations comportementales d’un HX thoracique, le principe peut être appliqué à d’autres SCIs incomplètes et à d’autres niveaux de la blessure.
Les lésions incomplètes de la moelle épinière (SCI) conduisent souvent à des déficiences graves et persistantes des fonctions sensorimotrices et sont cliniquement le type le plus fréquent de SCI1. Le syndrome de Brown-Séquard chez l’homme est causé par une lésion à la moitié de la moelle épinière qui entraîne la paralysie et la perte de proprioception sur le même côté (ou ipsilesional) que la blessure, et la perte de la douleur et la sensation de température sur le côté opposé (ou contralesional)2,3,4. Les modèles animaux d’hémisection latérale spinale sont employés largement pour imiter le syndrome humain de Brown-Séquard et ils ont été rapportés chez les rats5,6,7,87,9,opossums10, et singes7,11,12,13 par divers laboratoires à divers niveaux spinals. Cependant, les procédures visualisées détaillées pour produire une hémisection latérale standard n’ont pas été décrites. Fournir des procédures étape par étape pour une hémisection latérale devrait optimiser le modèle et faciliter la comparaison ou la réplication des résultats expérimentaux dans la recherche fondamentale et translationnelle.
Une SCI unilatérale produit des déficits de comportement asymétriques et disproportionnés qui sont difficiles à mesurer à l’aide d’évaluations conventionnelles pour les blessures symétriques. Une méthodologie adéquate pour évaluer les déficiences neurologiques pour une SCI unilatérale est un élément essentiel de l’élaboration d’un modèle unilatéral SCI. Malgré le rôle central d’une lésion unilatérale de la colonne vertébrale, les protocoles normalisés pour évaluer les déficits sensorimoteurs chez les animaux atteints d’une telle blessure font défaut. L’échelle d’évaluation locomotrice Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) a été la mesure la plus fréquemment utilisée de la fonction après SCI pour les rats adultes 14 qui donne une description semi-quantitative de la locomotion dans son ensemble. Cependant, il ne mesure pas chaque arrière-train de façon indépendante.
Dans cette étude, nous rapportons des procédures étape par étape pour produire un HX spinal de rongeur au niveau de 9e thoracic (T9) vertébral. Nous introduisons également une échelle de comportement combinée pour l’hémisection (CBS-HX) qui inclut le pas de l’arrière unilatéral (UHS), le couplage, le placement du contact, et les évaluations de marche de grille pour évaluer des affaiblissements neurologiques et la récupération après une SCI unilatérale. Nous espérons que ce modèle sera un modèle utile pour examiner les mécanismes de blessures et les efficacités thérapeutiques pour les SCIs unilatérales.
Dans cette étude, nous rapportons des procédures étape par étape pour produire un HX spinal T9 simple, cohérent et reproductible chez les rats adultes qui imite le syndrome de Brown-Séquard chez l’homme. Nous introduisons également un système combiné de score de comportement pour l’hémisection (CBS-HX) qui est sensible pour évaluer l’affaiblissement neurologique asymétrique et la progression de la récupération, mesurée par une combinaison de passation unilatérale de l’arrièrelimb (UHS), couplage (CPL), placer le contact et la marche de grille. Bien que nous manifestions la blessure au niveau de T9, cette procédure peut être appliquée à d’autres régions de la moelle épinière comprenant les moelles cervicales et lombaires d’une manière simple et peu exigeante. Nous espérons que ce modèle, ainsi que des évaluations comportementales unilatérales, seront utiles pour examiner les mécanismes de blessures et les efficacités thérapeutiques pour de tels types de SCI.
Puisque le modèle latéral HX ne diminue que la moitié ipsilateral du cordon, le côté contralatéral du cordon est largement préservé et peut être utilisé comme un contrôle interne. Beaucoup de voies descendantes et ascendantes sont projetées unilatéralement et une hemisection latérale dans de nombreuses circonstances cause des dommages à une région axonale d’un côté et préserve le même tract sur le côté opposé, permettant la comparaison de la réorganisation et conséquences fonctionnelles de ces tracts chez le même animal. En outre, la production d’une lésion plus localisée peut permettre le ciblage de voies spécifiques. Par exemple, une lésion ventrale et ventrolaterale peut affecter les voies réticulospinal et vestibulospinal. Une lésion dorsale ou dorsale peut affecter les voies corticospinal et rubrospinal. Le modèle d’hémisection ou de blessure partielle peut également être employé pour étudier l’anatomie et la fonction d’autres voies, telles que les voies propriospinal, norarénergic ou sérotonergic. Ainsi, le modèle d’hémisection peut être employé de façon unique pour étudier la compensation par les afferents sensoriels, par les voies descendantes, et par les circuits intrinsèques de la colonne vertébrale. Ce modèle est également approprié pour étudier des mécanismes de récupération locomotrice après HX.
Le HX latéral conduit à des déficiences comportementales évidentes, qui sont évaluables dans les tâches motrices (par exemple, Treadscan ou Tapis roulant) paradigme pour l’analyse automatisée de la démarche 19. En outre, la conductivité des voies axonales sur le côté contralatéral à la lésion pourrait être mesurée à l’aide d’enregistrements électrophysiologiques, et cette évaluation fournit la possibilité d’établir une réorganisation fonctionnelle après divers traitements. En outre, les injections unilatérales des traceurs anatomiques dans les neurones d’une voie particulière permettent la visualisation des fibres de croisement de ligne intermédiaire antélimé étiquetées et leur connexion avec les neurones étiquetés rétrograde20,21,22,23,24,25.
Bien qu’une chirurgie HX spinale typique prend moins de 20 minutes pour terminer, il faut une certaine pratique pour atteindre un HX précis et cohérent. Tout d’abord, il est important que le niveau de HX spinal soit cohérent d’un animal à l’autre. Par conséquent, il est essentiel que le segment vertébral approprié pour le laminectomy soit identifié. Deuxièmement, assurez-vous que le HX est terminé. Pour faire un HX complet, on peut utiliser une aiguille de calibre 30 insérée verticalement à travers la ligne médiane pour guider la coupe à l’aide de microsciseurs. L’insertion d’aiguille évite également des dommages aux vaisseaux spinals postérieurs ou à la moelle au-dessus de la lésion. La deuxième fonction de l’aiguille de calibre 30 est qu’elle peut servir de couteau pour tracer la coupe pour s’assurer qu’il n’y a aucune ambiguïté de la lésion. Troisièmement, placer la gélatine sur le site de lésion peut minimiser la fuite de liquide céphalo-rachidien, et placer le ciment sur le dessus de la gélatine et combler le lamina vertébral peut renforcer la stabilité des vertèbres vertébrales au site de lésion et faciliter la cicatrisation des plaies. Pour éviter l’interférence du signal avec l’application d’enregistrements électrophysiologiques, les muscles, le fascia et la peau doivent être suturés en couches avec 4-0 fil de soie. Enfin, tous les efforts doivent être faits pour minimiser les dommages à la moelle épinière contralatérale. Une vérification histologique devrait être établie pour confirmer une hémisection latérale complète d’un côté et la préservation de l’autre moitié du cordon de l’autre côté (comme le montre la figure 6E).
Pour améliorer la locomotion après SCI, des études antérieures ont utilisé un large éventail de stratégies, y compris la transplantation cellulaire, la régénération d’axone 8,18,26,27, et la réhabilitation basée sur l’activité 28,29,30. Pendant ce temps, plusieurs tests comportementaux ont été établis pour l’évaluation fonctionnelle et pour dépister les meilleurs traitements suivant SCI. L’échelle d’évaluation locomotrice BBB a été conçue pour l’évaluation locomotrice des blessures symétriques spinales telles qu’une contusion de mi-ligne ou des dommages transection qui affectent les hindlimbs bilatéraux 14,31. Certains paramètres de BBB, tels que la coordination et le dégagement des orteils, sont enregistrés en observant les deux arrière-ci. Si un arrière-plan est intact et que l’autre montre des déficits comme on le voit dans les blessures asymétriques, alors l’arrière-forme intacte confondra le score de l’arrière-forme affectée. Étant donné que la notation BBB ne tient pas compte d’un score postérieur de l’autre après la blessure unilatérale, il n’est pas idéal pour évaluer les blessures unilatérales de la moelle épinière. Toutefois, si le mouvement articulaire et le soutien du poids de chaque côté sont évalués séparément et ne sont pas calculés dans le cadre du BBB, alors l’arrière-forme intacte (semblable à un contrôle fictif) ne confondra pas la partition de l’arrière-forme affectée. En outre, le côté intact ne biaisera pas la note globale de l’animal, parce que l’arrière intact n’a pas de déficits dramatiques dans le mouvement articulaire, le soutien du poids, ou le pas.
Le score de comportement combiné pour l’hémisection est conçu pour être une évaluation sensible et facilement exécutée de la récupération comportementale dans le modèle de rat de l’hémisection latérale. Il peut être utilisé pour évaluer les comportements des phases précoces et tardives de récupération. La première phase est dans les 7-10 jours après le préjudice. Dans les 3-5 premiers jours post-HX, l’activité de l’arrière-courrier ipsilateral a augmenté régulièrement et devrait être évaluée plus fréquemment pour enregistrer des rétablissements spontanés ou de mouvement d’arrière-médiation de traitement. À 5-7 jours après HX, les rats ont commencé à faire des mouvements arrière-limites de balayage sans soutien de poids. Par 7-10 jours, les rats ont généralement commencé à se tenir debout et à marcher. Au cours de cette phase, l’attention portée au modèle de marche doit être accordée. À la phase tardive (14-28 jours), l’activité de l’arrière-courrier ipsilateral était stable et proche de la normale.
Une attention particulière devrait également être accordée à la capacité de couplage (CPL). Le test CPL (couplage de la démarche) peut être effectué soit avec une vidéo (p. ex., Treadscan/Catwalk) ou une vidéo de tournage lors d’un essai en plein champ. La deuxième option offre de la souplesse si les chercheurs n’ont pas accès au système d’analyse de la démarche. Pour les deux sessions d’enregistrement vidéo, un minimum de deux touchdowns consécutifs pour chaque pied est nécessaire pour ce test. Pour l’analyse, il existe trois paramètres de couplage : l’accouplement homologue, homogène et diagonal (étape 6.2). Chaque couplage implique un pied de référence et le pied donné. Prenez le couplage homologue (avant gauche-avant droite, ou arrière gauche-arrière droit) par exemple, c’est le premier temps de toucher du pied donné divisé par un temps de foulée entier du pied de référence. Étant donné que le pied gauche et droit devrait être hors phase, le couplage parfait devrait être de 0,5. C’est le même cas dans le couplage homolatéral (arrière gauche front-gauche, ou arrière droit avant-droite). Cependant, pour le couplage diagonal (arrière gauche avant-droite, ou arrière avant-gauche de droite), le couplage parfait devrait être de 0 ou 1 puisque les deux pieds devraient être en phase. Dans l’étape 6.4, nous attribuons un score pour chaque CPL de 0 à 2. Dans les détails, un score 0 doit représenter le pied donné est incapable de se déplacer pour terminer un touché, donc pas de CPL; un score 1 représente tout CPL irrégulier ou maladroit puisque le pied donné termine un touché, mais pas dans le couplage parfait; un score 2 signifie un couplage parfait de 0,5. Les trois concepts de paramètre de couplage sont bien décrits dans les publications précédentes32,33. Le CPL peut être combiné avec les évaluations du placement de contact et de la marche sur la grille. Les composants individuels du système combiné de notation de comportement seront plus ou moins efficaces dans différents modèles de rat de SCI. Pour CPL, les déficits sont devenus évidemment visibles dans le taux d’alternance et l’exhaustivité de la séquence. L’arrière proprioceptif plaçant des déficits pourrait être clairement révélé après HX unilatéral. Dans notre étude, tous les rats ont montré l’arrière-limite ipsilesional plaçant des déficits tandis que le placement contralatéral de l’arrière-cour n’a montré aucun déficit. L’essai de marche de grille devrait être considéré quand le placement de contact, qui implique le tractus corticospinal, commence à récupérer. Pour écarter tout problème de fatigue possible, la séquence de tests comportementaux pourrait être randomisée à chaque test.
En conclusion, nous rapportons des procédures étape par étape pour créer un modèle reproductible de rat in vivo du HX spinal T9 qui imite le syndrome de Brown-Séquard chez l’homme. Le système combiné de notation de comportement pour l’hémisection offre une mesure plus discriminante des résultats comportementaux arrières individuels pour évaluer des mécanismes et des traitements de blessure après une SCI unilatérale. Bien que nous fournissions seulement une description visuelle des procédures chirurgicales et des évaluations comportementales d’un HX thoracique, les méthodes décrites ici peuvent être appliquées à d’autres SCIs incomplètes à différents niveaux de blessure.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions M. Jeffrey Recchia-Rife pour son excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu en partie par la Fondation du Directeur de l’Hôpital Général de la Région Militaire de Jinan de Chines PLA 2016ZD03 et 2014ZX01 (XJL et TBZ). La recherche dans le laboratoire Xu est soutenue par NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481, et Merit Review Award I01 BX0002356, I01 BX003705, IX002687 du ministère des Anciens Combattants des États-Unis.
Baby-Mixter Hemostat | FST | 13013-14 | Can be any brand of choice |
Elevated plastic coated wire mesh grid | Any | 36×38 cm with 3 cm2 openings | |
Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. |
Microbead Sterilizer | FST | NA | Can be any brand of choice |
Pearson Rongeur | FST | 16015-17 | Can be any brand of choice. |
Retractors | Jinxie surgical tools | 6810 | Can be any brand of choice |
Scalpel Handle | FST | 10003-12 | Can be any brand of choice |
Simplex-P cement | Stryker | Can be any brand of choice. | |
TreadScan automatic gait analysis | CleverSys Inc | NA | Can be any brand of choice |