여기에서 우리는 성인 쥐에 있는 9th 흉부 수준에서 믿을 수 있는 척수 측삭 측수 (HX)를 생성하기 위하여 외과 적 절차를 기술하고 그러한 일방적인 상해 후에 비대칭 적자를 검출하기 위하여 디자인된 신경 행동 평가.
불완전한 척수 손상 (SCI)은 종종 감각 운동 기능의 손상으로 이어지며 임상적으로 SCI의 가장 빈번한 유형입니다. 인간 브라운 – 세커드 증후군은 병변으로 인한 일반적인 유형의 불완전한 SCI로 인해 척수의 절반에 대한 병변으로 인해 마비및 프로피오셉션의 손실이 발생하며(또는 ipsilesional) 측의 상해, 및 통증의 손실과 같은 측면(또는 ipsilesional) 측의 손실과 같은 측면의 통증과 같은 측면(또는 ipsilesional) 측의 손실과 같은 측면의 통증이 있습니다. 척수 측면 위축부 (HX)를 생성하고 신경 장애를 평가하기위한 적절한 방법론은 브라운 세커드 증후군의 신뢰할 수있는 동물 모델을 확립하는 데 필수적입니다. 측면 반구 모델은 기본 및 번역 연구에서 중추적 인 역할을하지만, 이러한 반구를 만들고 일방적 인 기능을 평가하기위한 표준화 된 프로토콜은 부족합니다. 이 연구의 목표는9th 흉부 (T9) 척추 수준에서 쥐 척추 측측 HX를 생산하는 단계별 절차를 설명하는 것입니다. 그런 다음 일방적인 SCI에 대한 비대칭 신경 성능에 대한 간단하고 민감한 평가를 제공하는 HX(CBS-HX)에 대한 결합된 동작 척도를 설명합니다. 0부터 18까지의 CBS-HX는 일방적인 뒷다리 스테핑(UHS), 커플링, 접촉 배치 및 그리드 워킹을 포함하는 4개의 개별 평가로 구성됩니다. CBS-HX의 경우, 동측 및 반대 측 뒷다리는 별도로 평가됩니다. 우리는 T9 HX 후에, 동측 뒷다리가 손상된 행동 기능을 보인 반면, 반대측 뒷다리는 상당한 회복을 보였다는 것을 것을을 발견했습니다. CBS-HX효과적으로 동측 및 반대 측 뒷다리 사이의 행동 기능을 차별하고 동측 뒷다리의 회복의 시간적 진행을 감지. CBS-HX 부품은 필요할 때 별도로 또는 다른 측정값과 함께 분석할 수 있습니다. 우리는 흉부 HX의 외과 적 절차 및 행동 평가의 시각적 설명을 제공하지만, 원칙은 다른 불완전한 SI및 부상의 다른 수준에 적용 될 수있다.
불완전한 척수 상해 (SCI)는 수시로 감각 운동 기능의 가혹하고 지속적인 손상으로 이끌어 내고 임상으로 SCI1의가장 빈번한 모형입니다. 인간에 있는 갈색 Séquard 증후군은 상해와 같은 (또는 ipsilesional) 측에 마비 그리고 proprioception의 손실 귀착되는 척수의 반에 병변에 기인하고, 반대에 있는2고통 및 온도 감각의 손실2,3,,4. 척추 측위 동물 모델은 인간 브라운-세쿼드 증후군을 모방하기 위해 광범위하게 사용되며, 다양한 척추 수준에서 다양한,실험실에서 쥐5,,6,7,78,,9,opossums10,및 원숭이7,11,,12,,13에서 보고되었다., 그러나, 표준 측면 반구를 생성하기 위한 상세한 가시화 절차는 기술되지 않았습니다. 측면 위면에 대한 단계별 절차를 제공하는 것은 모델을 최적화하고 기본 및 번역 연구에서 실험 결과의 비교 또는 복제를 용이하게해야합니다.
일방적인 SCI는 대칭 상해에 대한 기존의 평가를 사용하여 측정하기 어려운 비대칭 및 불균형 행동 적자를 생성합니다. 일방적인 SCI에 대한 신경학적 장애를 평가하기 위한 적절한 방법론은 일방적인 SCI 모델을 개발하는 데 필수적인 요소입니다. 일방적 인 척추 부상의 중추적 인 역할에도 불구하고, 그러한 부상을 입은 동물의 감각 운동 적자를 평가하기위한 표준화 된 프로토콜은 부족합니다. Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) 운동 등급 척도는 전체적으로 운동의 반정적 설명을 산출하는 성인 쥐 14에 대한 SCI 후 기능의 가장 자주 사용되는 측정되었습니다. 그러나 각 뒷다리를 독립적으로 측정하지는 않습니다.
이 연구에서는, 우리는 9th 흉부 (T9) 척추 수준에서 설치류 척추 HX를 생성하기 위한 단계별 절차를 보고합니다. 또한 일방적인 SCI 후 신경 장애 및 회복을 평가하기 위한 일방적인 뒷다리 스테핑(UHS), 커플링, 배치 접촉 및 그리드 걷기 평가를 포함하는 반구(CBS-HX)에 대한 결합된 행동 척도를 소개합니다. 우리는 이 모형이 일방적인 SI를 위한 상해 기계장치 그리고 치료 효율성을 검토를 위한 유용한 모형이 되기를 바랍니다.
이 연구에서는, 우리는 인간에 있는 갈색 Séquard 증후군을 모방하는 성인 쥐에 있는 간단하고, 일관되고, 재현가능한 T9 척추 HX를 생성하기 위한 단계별 절차를 보고합니다. 우리는 또한 일방적 인 뒷다리 스테핑 (UHS), 커플링 (CPL)의 조합으로 측정 된 비대칭 신경 장애 및 회복 진행을 평가하는 데 민감한 hemisection (CBS-HX)에 대한 결합 된 행동 점수 시스템을 도입합니다. 접촉을 배치하고 그리드 걷기. 우리는 T9 수준에서 상해를 보여주더라도, 이 절차는 간단하고 까다로운 방법으로 자궁 경관과 요추를 포함하여 척수의 그밖 지구에 적용될 수 있습니다. 우리는 이 모형이 일방적인 행동 평가와 더불어, SCI의 그 같은 모형을 위한 상해 기계장치 및 치료 효율성을 검토하기 를 위해 유용할 것이라는 점을 희망합니다.
측면 HX 모델은 코드의 동측 절반만 병변하기 때문에 코드의 반대쪽면이 크게 보존되어 내부 제어로 사용할 수 있습니다. 많은 하강 및 오름차순 경로는 일방적으로 투영되고 많은 상황에서 측면 위misection은 한쪽에 축삭 에 손상을 생성하고 반대편에 같은 지역을 보존, 재구성및 비교를 허용 같은 동물에서 이러한 지역의 기능적 결과. 또한, 보다 국소화된 병변을 생산하는 것은 특정 경로의 표적화를 허용할 수 있다. 예를 들면, 복부 및 심방 병변은 망상 척추 및 현관 병에 영향을 미칠 수 있습니다. 등측 또는 등측 병변은 코르티코피종 및 루브로스피날 경로에 영향을 줄 수 있습니다. 위면 또는 부분 상해 모형은 또한 propriospinal, noradrenergic 또는 세로토닌성 통로와 같은 그밖 통로의 해부학 그리고 기능을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다. 따라서, 지부장 모델은 감각 구심질, 내림차순 통로 및 본질적인 척추 회로에 의한 보상을 연구하기 위해 유일하게 사용될 수 있습니다. 이 모델은 HX 후 운동 회수 메커니즘을 조사하는 데도 적합합니다.
측면 HX는 자동 걸음걸이 분석 19에대한 모터 작업(예: 트레드스캔 또는 러닝머신) 패러다임하에서 평가가능한 명백한 행동 장애로 이어집니다. 또한, 병변에 대한 반대측의 축삭 전도도는 전기생리학적 기록을 사용하여 측정될 수 있으며, 이러한 평가는 다양한 치료에 따른 기능적 재구성을 확립할 수 있는 가능성을 제공한다. 더욱이, 특정 통로의 뉴런에 해부학 적 추적자의 일방적 인 주사는 역행 라벨 뉴런20,,21,,22,,23,,24,,25와의 전방 표지 된 중간선 교차 섬유의 시각화를 허용한다.
일반적인 척추 HX 수술은 완료하는 데 20 분 미만이 걸리지만 정확하고 일관된 HX를 달성하기 위해서는 몇 가지 연습이 필요합니다. 첫째, 척추 HX 수준이 동물에서 동물로 일관되는 것이 중요합니다. 따라서, laminectomy를 위한 적당한 척추 세그먼트가 확인되는 것이 중요합니다. 둘째, HX가 완료되었는지 확인합니다. 완전한 HX를 만들기 위해 미드라인을 통해 수직으로 삽입된 30게이지 바늘을 사용하여 마이크로사이저를 사용하여 절단을 안내할 수 있습니다. 바늘 삽입은 또한 병변을 통해 후방 척추 혈관 또는 코드에 손상을 방지합니다. 30 게이지 바늘의 두 번째 기능은 병변의 모호성이 없는지 확인하기 위해 절단을 추적하는 칼역할을 할 수 있다는 것입니다. 셋째, 병변 부위에 젤라틴을 배치하면 뇌척수액 누출을 최소화할 수 있으며, 젤라틴 위에 시멘트를 놓고 척추 라미를 연결하면 병변 부위에서 척추 척추의 안정성을 강화하고 상처 치유를 용이하게 할 수 있습니다. 전기 생리학적 기록, 근육, 근막 및 피부의 응용 프로그램과 신호 간섭을 방지하기 위해 4-0 실크 스레드와 층으로 봉합되어야한다. 마지막으로, 반대 척수의 손상을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울여야합니다. 조직학적 검증은 한쪽에 완전한 측면 반구를 확인하고 다른 쪽에 있는 코드의 나머지 절반을 보존하기 위해 확립되어야 합니다(그림 6E와같이).
SCI 후 운동을 개선하기 위해, 이전 연구는 세포 이식, 축세포 재생 8,,18,,26,,27,및 활동 기반 재활 28,29,,30을포함한 다양한 전략을 활용했다., 한편, 기능 적 평가를 위해 그리고 SCI 다음 최고의 치료를 위해 선별하기 위해 여러 가지 행동 테스트가 확립되었습니다. BBB 운동 등급 척도는 양측 뒷다리에 영향을 미치는 중간 선 타박상 또는 transection 부상과 같은 척추 대칭 부상의 운동 평가를 위해 설계되었습니다 14,,31. 조정 및 발가락 클리어런스와 같은 BBB의 특정 매개변수는 두 뒷다리를 관찰하여 기록됩니다. 한 뒷다리가 손상되지 않고 다른 하나는 비대칭 부상에서 볼 수있는 적자를 보여줍니다 경우, 그대로 뒷다리는 영향을받는 뒷다리의 점수를 혼동합니다. BBB 점수는 일방적 인 부상 후 다른 하나의 뒷다리 점수를 수용하지 않기 때문에, 그것은 일방적 인 척수 부상을 평가하기에 적합하지 않습니다. 그러나, 각 측의 관절 운동과 체중 지지체가 별도로 평가되고 BBB의 일부로 계산되지 않으면 손상되지 않은 뒷다리 (가짜 대조군과 유사)는 영향을받는 뒷다리의 점수를 혼동하지 않습니다. 또한, 그대로 측면은 동물의 전체 점수를 편향하지 않습니다, 그대로 뒷다리는 관절 운동에 극적인 적자를 가지고 있지 않기 때문에, 체중 지원, 또는 스테핑.
반면에 대한 결합 된 행동 점수는 측측 의 쥐 모델에서 행동 회복에 민감하고 쉽게 수행 된 평가되도록 설계되었습니다. 그것은 복구의 초기 및 후반 단계 의 동작을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 초기 단계는 부상 후 7-10 일 이내에 있습니다. 처음 3-5 일 후 HX에서, 원소 뒷다리 활동은 꾸준히 증가하고 자발적 또는 치료 매개 뒷다리 운동 회복을 기록하기 위해 더 자주 평가되어야한다. HX 후 5-7 일, 쥐는 체중 지원없이 전면적인 뒷다리 운동을하기 시작했다. 7-10 일까지, 쥐는 전형적으로 서서 단계하기 시작했습니다. 이 단계에서는 스테핑 패턴에 주의를 기울여야 합니다. 후반 단계 (14-28 일)에서, 원소 뒷다리 활동은 안정적이고 정상에 가까웠다.
또한 CPL(커플링) 용량에 세심한 주의를 기울여야 합니다. CPL 테스트(걸음걸이 커플링)는 비디오(예: 트레드스캔/캣워크) 또는 오픈 필드 테스트 중에 촬영 비디오로 수행할 수 있습니다. 두 번째 옵션은 연구원이 걸음걸이 분석 시스템에 액세스할 수 없는 경우 유연성을 제공합니다. 두 비디오 녹화 세션 모두 이 테스트에는 각 발에 대해 최소 2번의 연속 터치다운이 필요합니다. 분석을 위해 상동, 상동 및 대각선 커플링(6.2단계)의 세 가지 커플링 매개변수가 있습니다. 각 커플링은 참조 발과 주어진 발을 포함한다. 상동 커플링 (정면 왼쪽 앞 오른쪽, 또는 뒷뒤 왼쪽 뒤 오른쪽)을 가지고, 그것은 참조 발의 하나의 전체 보폭 시간으로 나누어 주어진 발의 첫 번째 터치 다운 시간입니다. 왼쪽 과 오른쪽 발은 위상을 벗어나야하기 때문에 완벽한 결합은 0.5여야합니다. 이것은 동측 커플링 (왼쪽 앞뒤 뒷뒤 또는 오른쪽 앞뒤 뒷뒤)에서 동일한 경우입니다. 그러나 대각선 커플링(왼쪽 앞뒤-오른쪽 뒷뒤 또는 오른쪽 앞뒤 뒷다리)의 경우 두 발이 위상에 있어야 하므로 완벽한 커플링은 0 또는 1이어야 합니다. 6.4단계에서는 각 CPL에 대해 점수를 0에서 2로 할당합니다. 세부 사항에서, 점수 0은 주어진 발이 터치 다운을 완료하기 위해 이동할 수 없음을 나타내야하며, 따라서 CPL이 없습니다. 점수 1은 주어진 발이 터치다운을 완료하지만 완벽한 커플링이 아니기 때문에 불규칙하거나 서투른 CPL을 나타냅니다. 점수 2는 0.5의 완벽한 커플링을 의미합니다. 세 개의 커플링 파라미터 개념은 이전 간행물32,,33에잘 설명되어 있다. CPL은 접촉 배치 및 그리드 보행의 평가와 결합될 수 있다. 결합된 동작 스코어링 시스템의 개별 성분은 SCI의 상이한 래트 모델에서 다소 효과적일 것이다. CPL의 경우, 적자는 교대속도와 시퀀스의 완전성에서 명백하게 드러났다. 적자를 배치하는 proprioceptive 뒷다리는 명확하게 일방적 인 HX 후 공개 될 수있다. 우리의 연구에서, 모든 쥐는 반대 측 뒷다리 배치가 적자를 보여주지 않는 동안 적자를 배치 ipsilesional 뒷다리를 보여 주었다. 코르티코척추관을 수반하는 접촉 배치가 회복되기 시작할 때 그리드 보행 테스트를 고려해야합니다. 가능한 피로 문제를 배제하기 위해 각 테스트에서 행동 테스트 의 순서를 무작위로 할 수 있습니다.
결론적으로, 우리는 인간에 있는 갈색 Séquard 증후군을 모방하는 T9 척추 HX의 생체 내 쥐 모형을 창조하기 위하여 단계별 절차를 보고합니다. 반구에 대한 결합 된 행동 점수 시스템은 일방적 인 SCI 후 부상 메커니즘과 치료를 평가하기위한 개별 뒷다리 행동 결과의 보다 차별적인 측정을 제공합니다. 우리는 흉부 HX의 외과 적 절차 및 행동 평가의 시각적 설명을 제공하지만, 여기에 설명 된 방법은 다른 부상 수준에서 다른 불완전한 SI에 적용 될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
제프리 레키아-리무트 회장님의 탁월한 기술 지원에 감사드립니다. 이 작품은 2016ZD03 및 2014ZX01 (XJL 및 TBZ)의 진안 군립 지역 원장 재단에 의해 부분적으로 지원되었습니다. Xu 실험실의 연구는 NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481 및 메리트 리뷰 어워드 I01 BX002356, I01 BX003705, I01 RX002687에 의해 미국 재향 군인 사무국의 지원을 받고 있습니다.
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