Aquí describimos los procedimientos quirúrgicos para producir una hemisección lateral de la médula espinal confiable (HX) a nivel torácico de 9o9 en ratas adultas y evaluaciones neuroconductuales diseñadas para detectar déficits asimétricos después de una lesión unilateral de este tipo.
La lesión incompleta de la médula espinal (SCI) a menudo conduce a deficiencias de las funciones sensorimotores y es clínicamente el tipo más frecuente de SCI. El síndrome de Brown-Séquard humano es un tipo común de SCI incompleto causado por una lesión a la mitad de la médula espinal que resulta en parálisis y pérdida de propriocepción en el mismo lado (o ipsilesional) que la lesión, y pérdida de dolor y sensación de temperatura en el lado opuesto (o contralesional). Las metodologías adecuadas para producir una hemisección lateral de la médula espinal (HX) y evaluar las deficiencias neurológicas son esenciales para establecer un modelo animal confiable del síndrome de Brown-Séquard. Aunque el modelo de hemisección lateral desempeña un papel fundamental en la investigación básica y traslacional, faltan protocolos estandarizados para crear una hemisección de este tipo y evaluar la función unilateralizada. El objetivo de este estudio es describir los procedimientos paso a paso para producir un HX lateral de la columna vertebral de la rata en el nivel vertebral torácico9 (T9). A continuación, describimos una escala de comportamiento combinada para HX (CBS-HX) que proporciona una evaluación simple y sensible del rendimiento neurológico asimétrico para sCI unilateral. El CBS-HX, que oscila entre 0 y 18, se compone de 4 evaluaciones individuales que incluyen pasos unilaterales de las extremidades posteriores (UHS), acoplamiento, colocación de contacto y caminar por la red. En el caso de CBS-HX, las extremidades posteriores ipsilaterales y contralaterales se evalúan por separado. Encontramos que, después de un HX T9, la extremidad posterior ipsilateral mostró una función de comportamiento deteriorada, mientras que la extremidad posterior contralateral mostró una recuperación sustancial. El CBS-HX discriminaba eficazmente las funciones conductuales entre las extremidades posteriores ipsilaterales y contralaterales y detectaba la progresión temporal de la recuperación de la extremidad posterior ipsilateral. Los componentes CBS-HX se pueden analizar por separado o en combinación con otras medidas cuando sea necesario. Aunque solo proporcionamos descripciones visuales de los procedimientos quirúrgicos y evaluaciones del comportamiento de un HX torácico, el principio puede aplicarse a otros ISC incompletos y a otros niveles de la lesión.
Las lesiones incompletas de la médula espinal (SCI) a menudo conducen a deficiencias graves y persistentes de las funciones sensorimotory son clínicamente el tipo más frecuente de SCI1. El síndrome de Brown-Séquard en humanos es causado por una lesión a la mitad de la médula espinal que resulta en parálisis y pérdida de propriocepción en el mismo lado (o ipsilesional) que la lesión, y pérdida de dolor y sensación de temperatura en el lado opuesto (o contralesional) lado2,3,4. Los modelos animales de hemisección lateral espinal se utilizan ampliamente para imitar el síndrome humano de Brown-Séquard y se han7notificado en ratas65,,6,7,8,9, opossums10,y monos 7,11,12,13 por varios laboratorios a varios niveles de la columna vertebral. Sin embargo, no se han descrito procedimientos visualizados detallados para producir una hemisección lateral estándar. Proporcionar procedimientos paso a paso para una hemisección lateral debe optimizar el modelo y facilitar la comparación o replicación de los resultados experimentales en la investigación básica y traslacional.
Un SCI unilateral produce déficits de comportamiento asimétricos y desproporcionados que son difíciles de medir utilizando evaluaciones convencionales para lesiones simétricas. Una metodología adecuada para evaluar las deficiencias neurológicas para un CIS unilateral es un componente esencial para desarrollar un modelo unilateral de CIS. A pesar del papel fundamental de una lesión espinal unilateral, faltan protocolos estandarizados para evaluar los déficits sensorimotores en animales con tal lesión. La escala de clasificación locomotora Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) ha sido la medida más utilizada de la función después de SCI para ratas adultas 14 que produce una descripción semicuantitativa de la locomoción en su conjunto. Sin embargo, no mide cada extremidad posterior de forma independiente.
En este estudio, informamos de procedimientos paso a pasoth para producir un HX espinal de roedores en el nivel vertebral de 9 otorácicos (T9). También introducimos una escala de comportamiento combinada para la hemisección (CBS-HX) que incluye pasos unilaterales de las extremidades posteriores (UHS), acoplamiento, colocación de contacto y evaluaciones de caminar en la red para evaluar las deficiencias neurológicas y la recuperación después de un SCI unilateral. Esperamos que este modelo sea un modelo útil para examinar los mecanismos de lesión y las eficacias terapéuticas para los ISC unilaterales.
En este estudio, informamos de procedimientos paso a paso para producir un HX espinal T9 simple, consistente y reproducible en ratas adultas que imita el Síndrome de Brown-Séquard en humanos. Además, introducimos un sistema combinado de puntuación de comportamiento para la hemisección (CBS-HX) que es sensible a evaluar el deterioro neurológico asimétrico y la progresión de la recuperación, medido por una combinación de paso unilateral en las extremidades posteriores (UHS), acoplamiento (CPL), poner contacto y caminar en la rejilla. Aunque demostramos la lesión a nivel T9, este procedimiento se puede aplicar a otras regiones de la médula espinal, incluyendo las cuerdas cervicales y lumbares de una manera simple y poco exigente. Esperamos que este modelo, junto con las evaluaciones de comportamiento unilateralizadas, sea útil para examinar los mecanismos de lesión y las eficacias terapéuticas para este tipo de SCI.
Dado que el modelo HX lateral sólo lesiona la mitad ipsilateral del cordón, el lado contralateral del cordón se conserva en gran medida y se puede utilizar como control interno. Muchas vías descendentes y ascendentes se proyectan unilateralmente y una hemisección lateral en muchas circunstancias produce daños a un tracto axonal en un lado y preserva el mismo tracto en el lado opuesto, permitiendo la comparación de la reorganización y consecuencias funcionales de estos tratados en el mismo animal. Además, la producción de una lesión más localizada puede permitir la focalización de vías específicas. Por ejemplo, una lesión ventral y ventrolateral puede afectar las vías reticuloespinal y vestibuloespinal. Una lesión dorsal o dorsolateral puede afectar las vías corticoespinal y rubroespinal. El modelo de hemisección o lesión parcial también se puede utilizar para estudiar la anatomía y la función de otras vías, como las vías propriospinales, noradrenérgicas o serotonérgicas. Por lo tanto, el modelo de hemisección se puede emplear de forma única para estudiar la compensación por afferents sensoriales, por vías descendentes y por circuitos espinales intrínsecos. Este modelo también es adecuado para la investigación de mecanismos de recuperación locomotora después de HX.
El HX lateral conduce a deficiencias conductuales obvias, que son evaluables bajo tareas motoras (por ejemplo, Treadscan o Treadmill) paradigma para el análisis automatizado de la marcha 19. Además, la conductividad de los tracto axonales en el lado contralateral de la lesión podría medirse utilizando grabaciones electrofisiológicas, y esta evaluación proporciona la posibilidad de establecer una reorganización funcional después de varios tratamientos. Por otra parte, las inyecciones unilaterales de los trazadores anatómicos en las neuronas de una vía particular permiten la visualización de fibras de cruce de línea media etiquetadas anterogradomente y su conexión con neuronas etiquetadas retrogradamente20,,21,22,23,,24,25.
Aunque una cirugía típica de HX espinal tarda menos de 20 minutos en terminar, requiere cierta práctica para lograr un HX preciso y consistente. En primer lugar, es importante que el nivel de HX espinal sea consistente de animal a animal. Por lo tanto, es fundamental que se identifique el segmento vertebral adecuado para la laminectomía. En segundo lugar, asegúrese de que el HX esté completo. Para hacer un HX completo, se puede utilizar una aguja de calibre 30 insertada verticalmente a través de la línea media para guiar el corte utilizando microtijeras. La inserción de la aguja también evita daños en los vasos espinales posteriores o en el cordón cefalorraquídeo. La segunda función de la aguja de calibre 30 es que puede servir como un cuchillo para rastrear el corte para asegurarse de que no hay ambiguedad de la lesión. En tercer lugar, colocar gelatina en el sitio de la lesión puede minimizar la fuga de líquido cefalorraquídeo, y colocar el cemento encima de la gelatina y puentear la lámina vertebral puede fortalecer la estabilidad de las vértebras espinales en el sitio de la lesión y facilitar la cicatrización de la herida. Para evitar la interferencia de la señal con la aplicación de grabaciones electrofisiológicas, los músculos, la fascia y la piel deben suturarse en capas con hilo de seda 4-0. Por último, se debe hacer todo lo posible para minimizar el daño a la médula espinal contralateral. Debe establecerse una verificación histológica para confirmar una hemisección lateral completa por un lado y la preservación de la otra mitad del cordón en el otro lado (como se muestra en la Figura 6E).
Para mejorar la locomoción después de SCI, estudios previos han utilizado una amplia gama de estrategias incluyendo trasplante de células, regeneración de axón 8,18,26,27, y rehabilitación basada en la actividad 28,29,30. Mientras tanto, se han establecido varias pruebas de comportamiento para la evaluación funcional y para detectar los mejores tratamientos después de SCI. La escala de clasificación del locomotor BBB fue diseñada para la evaluación locomotora de lesiones simétricas espinales, como una contusión de línea media o lesiones de transección que afectan a las extremidades posteriores bilaterales 14,31. Ciertos parámetros de BBB, como la coordinación y la eliminación de los dedos de los pies, se registran observando ambas extremidades posteriores. Si una extremidad posterior está intacta y la otra muestra déficits vistos en lesiones asimétricas, entonces la extremidad posterior intacta confundirá la puntuación de la extremidad posterior afectada. Dado que la puntuación BBB no acomoda una puntuación de la extremidad posterior de la otra después de la lesión unilateral, no es ideal para evaluar lesiones unilaterales de la médula espinal. Sin embargo, si el movimiento de las articulaciones y el soporte de peso en cada lado se evalúan por separado y no se calculan como parte del BBB, entonces la extremidad posterior intacta (similar a un control falso) no confundirá la puntuación de la extremidad posterior afectada. Además, el lado intacto no sesgará la puntuación general del animal, porque la extremidad posterior intacta no tiene déficits dramáticos en el movimiento articular, el soporte de peso o el paso.
La puntuación de comportamiento combinada para hemisection está diseñada para ser una evaluación sensible y fácil de realizar de la recuperación conductual en el modelo de rata de hemisección lateral. Se puede utilizar para evaluar los comportamientos de las fases tempranas y tardías de la recuperación. La fase inicial es dentro de 7-10 días después de la lesión. En los primeros 3-5 días después de la HX, la actividad ipsilateral de las extremidades posteriores aumentó constantemente y debe evaluarse con mayor frecuencia para registrar recuperaciones espontáneas o mediadas por el movimiento de las extremidades posteriores mediadas por el tratamiento. A los 5-7 días después de HX, las ratas comenzaron a hacer movimientos de las extremidades posteriores sin apoyo de peso. A los 7-10 días, las ratas típicamente comenzaron a ponerse de pie y dar un paso. Durante esta fase, se debe prestar atención al patrón de paso. En la fase tardía (14-28 días), la actividad ipsilateral de las extremidades posteriores fue estable y cercana a la normalidad.
También se debe prestar mucha atención a la capacidad de acoplamiento (CPL). La prueba CPL (acoplamiento de marcha) se puede realizar con un vídeo (por ejemplo, Treadscan/Catwalk) o con un vídeo de filmación durante una prueba de campo abierto. La segunda opción proporciona flexibilidad si los investigadores no tienen acceso al sistema de análisis de marcha. Para ambas sesiones de grabación de vídeo, se requiere un mínimo de dos touchdowns consecutivos para cada pie para esta prueba. Para el análisis, hay tres parámetros de acoplamiento: acoplamiento homólogo, homolateral y diagonal (paso 6.2). Cada acoplamiento implica un pie de referencia y el pie dado. Tome el acoplamiento homólogo (delantero izquierdo-delantero derecho, o trasero izquierdo-trasero derecho) por ejemplo, es el primer tiempo de touchdown del pie dado dividido por un tiempo de zancada entero del pie de referencia. Dado que el pie izquierdo y derecho debe estar fuera de fase, el acoplamiento perfecto debe ser 0,5. Este es el mismo caso en el acoplamiento homolateral (parte delantera izquierda izquierda, o parte delantera derecha derecha derecha). Sin embargo, para el acoplamiento diagonal (parte delantera-derecha izquierda, o parte delantera derecha izquierda), el acoplamiento perfecto debe ser 0 o 1 ya que los dos pies deben estar en fase. En el paso 6.4, asignamos una puntuación para cada CPL de 0 a 2. En detalle, una puntuación 0 representará que el pie dado no pueda moverse para terminar un touchdown, por lo tanto, no hay CPL; una puntuación 1 representa cualquier CPL irregular o torpe, ya que el pie dado termina un touchdown pero no en el acoplamiento perfecto; una puntuación 2 significa un acoplamiento perfecto de 0,5. Los tres conceptos de parámetros de acoplamiento están bien descritos en las publicaciones anteriores32,33. La CPL se puede combinar con las evaluaciones de la colocación de contactos y la marcha de la rejilla. Los componentes individuales del sistema de puntuación de comportamiento combinado serán más o menos eficaces en diferentes modelos de ratas de SCI. Para la CPL, los déficits se hicieron evidentes en la tasa de alternancia y la integridad de la secuencia. Los déficits de colocación de las extremidades posteriores proprioceptivas podrían revelarse claramente después de la HX unilateral. En nuestro estudio, todas las ratas mostraron déficits de colocación de la extremidad posterior ipsilesional, mientras que la colocación de la extremidad posterior contralateral no mostró déficits. La prueba de caminar en la rejilla debe considerarse cuando la colocación de contacto, que implica el tracto corticoespinal, comienza a recuperarse. Para descartar cualquier posible problema de fatiga, la secuencia de pruebas de comportamiento podría ser aleatoria en cada prueba.
En conclusión, informamos de procedimientos paso a paso para crear un modelo de rata in vivo reproducible del HX espinal T9 que imita el Síndrome de Brown-Séquard en humanos. El sistema combinado de puntuación de comportamiento para hemisección ofrece una medida más discriminatoria de los resultados de comportamiento individuales de las extremidades posteriores para evaluar los mecanismos y tratamientos de lesiones después de un SCI unilateral. Aunque solo proporcionamos una descripción visual de los procedimientos quirúrgicos y las evaluaciones del comportamiento de un HX torácico, los métodos descritos aquí se pueden aplicar a otros ISC incompletos a diferentes niveles de lesión.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al Sr. Jeffrey Recchia-Rife por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación del Director del Hospital General de la Región Militar de Jinan de Chines PLA 2016ZD03 y 2014ZX01 (XJL y TBZ). La investigación en el laboratorio Xu cuenta con el apoyo de NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481 y Merit Review Award I01 BX002356, I01 BX003705, I01 RX002687 del Departamento de Asuntos de Veteranos de los Estados Unidos.
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