심사에 생체 외에서 국물 Microdilution: 새로운 항진균 성 화합물을 감지 하는 쉽고 빠른 방법
Summary
항진균 성 화합물 및 추출 물 심사는 간단 하 고 융통성 있는 국물 microdilution 방법입니다.
Abstract
곰 팡이 감염 마지막 십 년간에 중요 한 의료 상태 되 있지만 사용 가능한 항진균 약물의 수는 제한. 이 시나리오에서는 새로운 항진균 약물에 대 한 검색이 필요 합니다. 여기 보고 프로토콜 화면 펩 티 드 그들의 항진균 속성에 대 한 방법을 자세히 설명 합니다. 그것은 잠재적인 새로운 antifungals로 항균 성 펩 티 드의 연구에 맞게 수정 임상 실험실 표준 협회 (CLSI) M27-A3 지침에서 국물 microdilution 자화 율 시험을 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 항진균 성 화합물의 활동을 평가 하는 기능 분석 결과 설명 하 고 조사 분자의 특정 클래스에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다. 분석 실험 96 잘 접시 작은 볼륨을 사용 하 여 수행 됩니다, 이후 대규모 심사 자동화 환경에서 실시 하는 경우에 특히 시간, 짧은 시간에 완료할 수 있습니다. 이 절차는 표준화 되 고 조정 가능한 임상 프로토콜 곰 팡이 질병의 치료를 개선 하기 위해 새로운 분자의 벤치 작업 추구를 도울 수 있는 방법를 보여 줍니다.
Introduction
곰 팡이 감염 되는 중요 한 의료 우려 최근 수십 년간, 상당히 immunocompromised 개인 등 암 치료 및 HIV/에이즈와 함께 사는 사람들의 숫자에 있는 상승 때문에 주로 증가 하는 데 또는 이식 장기1,2. 그러나, 매우 제한 된 배열 사용 가능한 항진균 약물의과 그들에 게 곰 팡이 저항에 대 한 보고서의 증가 조직의 사상 균 병3의 치료제에 관한 주요 문제에 기여.
새로운 항진균 성 화합물의 항균 성 펩 티 드 (암페어), 작은 양이온 펩 티 드 감염4그들의 타고 난 면역 반응의 일환으로 많은 유기 체에 의해 생산 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 심사 방법 곰 팡이 병원 균에 대 한 이러한 화합물을 테스트 하는 표준화 되지. 다른 절차 때때로 동일한 모델 미생물5,,67에 대 한 앰프의 항진균 활동을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 이러한 차이 부족의 일부 프로토콜 세부 화합물 및 저해 재현성 사이 비교를 복잡 하 게.
새로운 약 후보자의 테스트를 표준화 하기 위한 한 가지 방법은 항진균 민감성은 임상 등 임상 설정에서 정의 하는 데 사용 하는 지침 및 실험실 표준 협회 (CLSI) M27-A3 지침입니다. 그러나, 이러한 antifungal 감도 테스트 너무 제한적 그리고 받지 않습니다 고려 대사에서 변화에 종에 걸쳐 그들은 단지 몇 가지 선택 에이전트에 대 한 설립 했다. 예를 들어 그들은 할 고려 하지 계정 비 발효 효 모에의 대사 요구.
이 프로토콜 잠재 항진균 성 화합물의 활동의 평가 허용 하 고 항진균 펩 티 드에 대 한 검색에 대 한 여기에 구현 됩니다. 그것은 국물 microdilution 새로운 화합물8,9의 심사를 최적화 하는 수정 CLSI M27-A3 지침에서 시험 기반으로 합니다. 이러한 변경 내용은 컨트롤로 참조 antifungals 사용 하 여 결과 표준화 하는 동안 최적의 사전 테스트 성장 위한 소량의 화합물, 온도 또는 초기 inoculum와 다른 미디어를 사용 하 여 허용 합니다. 다 잘 배양 배지를 사용 하 여이 방법을 신속 하 고 안정적으로 화면 화합물의 많은 수를 가능 하 게.
그것의 고유의 유연성으로 인해이 프로토콜 및 몇 가지 각 색으로 다른 미생물에 대 한 화합물의 다른 화학 클래스와 함께 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microdilution 테스트는 화합물, 화합물의 소량을 사용 하 여 대상의 잠재적인 항진균 성 활동을 분석 하 고 동시에 농도의 범위에서 테스트 수 있습니다. 이 따라,이 프로토콜은 잠재적인 새로운 항진균 성 화합물에 대 한 심사의 첫 번째 단계도 권장 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜 처음 클리닉, 항진균 치료의 선택에 도움을 설계 되었습니다 M27-A3 프로토콜에 기반은 그리고 새로운 항진균 성 화합?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 망 토-브라질, CNPq-브라질, FAP/DF 재정 지원에 대 한 감사합니다. 우리는 수정 원고에 대 한 박사 휴고 코스타 Paes에 감사입니다.
Materials
| Media and Reagents | |||
| RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate | Thermo Fisher | 31800-022 | |
| 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um sódio, completa o nome dele please) | Sigma-Aldrich | Use to buffer 2X RPMI medium | |
| Sodium chloride (NaCl) | Dinâmica | 1528-1 | 137 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium chloride (KCl) | J.T.Baker | 3040-01 | 2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | V000129 | 10 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 60230 | 2 mM for Phosphate buffered saline (PBS) |
| BD Difco Sabouraud dextrose broth | BD | 238230 | |
| BD Difco Sabouraud Dextrose Agar | BD | 210950 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | V000123 | 35% for (solução de estoque? Criopreservação?) |
| Sterile water | Para diluição das drogas na diluição seriada | ||
| Antifungal drugs | |||
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Fluconazole | Sigma-Aldrich | F8929 | |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | PHR1160 | |
| Plastics | |||
| 50 mL conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Dish petri | J.Prolab | 0304-5 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Sterile Solution Reservoir | KASVI | K30-208 | Use to pippet the solutions using the multichannel pippet |
| Equipment and other materials | |||
| Optical microscope | Nikon | E200MV | |
| Centrifugue | Thermo Fisher | MegaFuge 16R | |
| Incubator | Ethik Technology | 403-3D | Set to 37° C |
| Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E25 | Set to 37° C, 200 RPM |
| Cell counting chamber, Neubauer | BOECO Germany | BOE 13 | |
| Multichannel pipette | HTL | 5123 |
References
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