Det här protokollet beskriver i detalj hur att fabricera och driva mikroflödessystem enheter för röntgendiffraktion datainsamling vid rumstemperatur. Dessutom, det beskriver hur du övervakar protein kristallisering av dynamiska ljusspridning och hur att bearbeta och analysera erhålls diffraktion data.
Det här protokollet beskriver fabricera mikroflödessystem enheter med låg röntgen bakgrund optimerad för goniometer baserade fasta mål seriell kristallografi. Enheterna är mönstrade från epoxi lim med mjuk litografi och lämpar sig för i situ röntgendiffraktion experiment vid rumstemperatur. Prov brunnarna är lock på båda sidor med polymera polyimid folie windows som tillåter diffraktion datainsamling med låg röntgen bakgrund. Denna tillverkning metod är kravlös och billig. Efter inköp av en SU-8 master wafer, kan alla fabrication slutföras utanför ett renrum i en typisk forskning laboratoriemiljö. Chip konstruktion och tillverkning protokollet utnyttja kapillär ventilsystem till microfluidically split en vattenlösning reaktion i definierade nliter storlek små droppar. Denna lastning mekanism undviker prov förlust från kanal döda-volym och kan enkelt utföras manuellt utan att använda pumpar eller annan utrustning för flytande aktivering. Vi beskriver hur isolerade nliter storlek droppar av protein lösning kan vara övervakade i situ av dynamiskt ljus spridning till kontroll protein crystal kärnbildning och tillväxt. Efter lämplig kristaller odlas, kan komplett röntgendiffraktion datamängder sugas upp med goniometer baserat i situ fast målet seriell röntgenkristallografi i rumstemperatur. Protokollet ger anpassade skript för att bearbeta diffraktion datamängder med en svit av verktyg för att lösa och förfina protein kristallstrukturen. Detta tillvägagångssätt undviker föremålen möjligen inducerad under cryo-bevarande eller manuell crystal hantering i konventionella kristallografi experiment. Vi presenterar och jämför tre proteinstrukturer som löstes med små kristaller med dimensioner på ca 10-20 µm odlas i chip. Utkristalliseras och diffracting i situ, hantering och därmed mekaniska störningar av sköra kristaller minimeras. Protokollet visar hur att fabricera en anpassad röntgen transparent mikroflödessystem chip passar i situ seriell kristallografi. Som nästan varje kristall kan användas för diffraktion datainsamling, är dessa mikroflödessystem marker en mycket effektiv crystal leveransmetod.
Att veta 3D-strukturen för ett protein som är viktigt att förstå dess funktionalitet. Nära-atomär upplösning strukturer erhålls hittills oftast av röntgenkristallografi. Denna teknik exponerar proteinkristaller till röntgenstrålning och de resulterande diffraktionsmönster analyseras sedan för strukturbestämning och förfining. I traditionella röntgenkristallografi registreras en komplett diffraktion datamängd från en enda, idealiskt stor, kristall vid kryogena temperaturer. Sådana kristaller, dock mestadels inte är trivialt att växa, och att identifiera lämplig cryo-bevarande villkor kan bli utmanande i sig och kan ibland också orsaka avvikelser från de infödda protein struktur5.
Senaste tekniska framsteg inom röntgen gratis-elektron laser (FEL) och synkrotron linjer har gjort för att lösa strukturer från mindre kristaller, som nya micro-fokus linjer, ökad X-ray balk briljans och förbättrad röntgen detektorer blev tillgänglig6,7. Små kristaller är oftast lättare att odla än stora och defekt gratis kristaller8,9. Små kristaller lider dock röntgen strålning skada mycket snabbare än stora kristaller. Detta beror på att jämfört med en stor kristall, en högre röntgen dos måste vara projicerad på en mindre crystal volym till gravering till jämförbar upplösning. Därför räcker det ofta inte med ens kryogen skydd för att spela in en komplett diffraktion datauppsättning från en enda microcrystal.
För att övervinna detta hinder, blivit seriell kristallografi vald analysmetod att samla in och slå samman diffraktionsmönster från många slumpmässigt orienterade microcrystals att erhålla en komplett datamängd. Strålning framkallad kristall skador minimeras genom att sprida den totala Röntga dosen används för att lösa en proteinstruktur över ett stort antal kristaller5,10. I en ‘ gravering innan förstöra ‘ FEL experiment, varje kristall används endast för en exponering med hjälp av femto-andra röntgen pulser. Micro-fokus linjer på tredje generationen synkrotron källor kan i sin tur utföra seriell kristallografi med några millisekund kort röntgen exponeringar11,12,13,14. Utan en crystal svängning eller rotation under datainsamling, dock endast partiell Bragg reflektioner kan registreras och därmed tiotusentals eller mer diffraktionsmönster krävs normalt för struktur bestämning15. Hittills har har en rad olika prov leveransmetoder utvecklats för seriell kristallografi, som nyligen granskade14,16,17,18,19. Bland dem, flera fast-mål baserat prov leverans strategier var framgångsrikt kombineras med crystal rotation under röntgen exponeringar sådan att betydligt färre diffraktionsmönster kan ge lika komplett datamängder och förbrukar dessutom mindre prov som jämfört till klassiskt seriell crystallography experiment där stillbilder är inspelad7,16,20,21,22,23 , 24.
Vi presenterar ett protokoll för att fabricera mikroflödessystem enheter med låg röntgen bakgrund. Enheterna är mönstrade från 5-min epoxy lim med mjuk litografi och lämpar sig för in situ – röntgendiffraktion experiment vid rumstemperatur som gynnas av att integrera provberedningen direkt i röntgen set-up, som fallet med tid-löst studier som följer blandning-inducerad kinetik18,19. Mikroflödessystem kanaler är lock på båda sidor med polymera polyimid folie, vilket resulterar i X-ray windows med en sammanlagd tjocklek på ca 16 µm som möjliggör låg röntgenfotografering bakgrund. Alla begagnade material ger god beständighet mot lösningsmedel. Denna tillverkning metod är comparably enkel och billig. Efter inköp av en SU-8 master wafer, kan alla fabrication slutföras utanför ett renrum i en typisk forskning lab miljö.
I ansökan exempelvis beskriver vi marker för goniometer baserade fasta mål seriell kristallografi. Först diskuteras av konstruktion och tillverkning överväganden för att använda kapillär ventilsystem till microfluidically split en vattenlösning reaktion i ett antal utvalda nliter storlek droppar. Denna lastning mekanism undviker prov förlust från kanal döda-volym och uppdelning kan enkelt utföras manuellt utan att använda pumpar eller annan utrustning för flytande aktivering. Sådana isolerade nliter storlek droppar av protein lösning är övervakade i situ med dynamisk ljusspridning (DLS) till kontroll protein crystal kärnbildning och tillväxt. Det har tidigare påvisats att DLS mätningar kan utföras i ultrakalla enheter bestående av en Polydimetylsiloxan (PDMS) struktur bundna till ett glas bild25,26. Eftersom polyimid lagret har en hög överföring för våglängder längre än 550 nm, metoden kan förlängas till mätningar i röntgen transparent chips också, när du använder en lämplig laser våglängd27,28. Baserat på DLS resultaten, inledande kärnbildning kan observeras, och ytterligare droplet avdunstning kan stoppas för att få färre men större proteinkristaller.
Efter tillräckligt kristaller odlas, kan komplett röntgendiffraktion datamängder sedan samlas med goniometer baserat i situ fast målet seriell röntgenkristallografi i rumstemperatur. Diffraktion datamängder bearbetas med en svit av programvaruverktyg och anpassade skript för att lösa protein kristallstrukturen. Denna teknik undviker artefakter ofta induceras under cryo-bevarande används i konventionella kristallografi experiment.
Vi jämför tre protein målstrukturer som löstes med ungefär 10-20 µm små kristaller odlas i chip till bättre då 2 Å upplösning. Utkristalliseras och diffracting i situ, hantering och därmed mekaniska störningar av sköra kristaller minimeras. Detta protokoll kan tillämpas för proteinkristaller som gravering på hög upplösning samt låg upplösning (1,7 Å till 3.0 Å). Som nästan varje kristall kan användas för diffraktion, lilla provet går till spillo, vilket gör detta till en mycket effektiv crystal leveransmetod.
Detta protokoll ger en detaljerad guide om hur du förbereder röntgen transparent mikroflödessystem chip i situ protein kristallisation och diffraktion datainsamling. Förfarandet var noggrant utformade för att gynna från mikroflödessystem precision utan avancerad utrustning i labbet. Också, datainsamling på den synkrotron beamline kan utföras utan en specialiserad goniometer eller luftfuktare att lindra reproducera resultaten av icke-experter. Presenterade tekniken kan tillämpas för seriell millisekund kristallografi datainsamling vid rumstemperatur samtidigt som den strålning skadan minimal och utan att införa stress till kristallerna efter tillväxten av cryo-skydd eller crystal hantering. Därför är den beskrivna metoden lämplig för alla protein kristallisering projekt.
Vi fabricera mikroflödessystem enheter för i situ röntgendiffraktion av mönstring epoxiharts som fyllning material och polyimid folie som fönster material. Vår procedur optimerad olika stegen i tillverkningsprocessen via tidigare röntgen chip Design16,21. Vi minskade tjockleken fönster och därmed bakgrunden spridning medan också lättnader fabrication som färre processteg krävs. i situ kristallisering använda protokollet beskrivs har betydande fördelar. Det tillåter diffraktion datainsamling vid rumstemperatur och utesluter därmed behovet av cryo skydd, som i vissa fall innehåller risken att införa artefakter i proteinstruktur. Kristallerna omfattas dessutom inte av fysisk stress, eftersom överföringen av kristallerna från sin ursprungliga miljö kan undvikas. Genom detta förfarande, kristallerna upprätthålla deras högsta kvalitet och lider inte av någon behandling.
Vår erfarenhet kretsa de mest kritiska steg inom protokollet kring styra kristallisation. Parametrar för att få Röntga lämplig kristaller med lämpliga dimensioner måste identifieras empiriskt och kan inte tas direkt från vapor diffusion experiment. Med identiska koncentrationer av protein och fällningsmedel resulterade inte alltid i kristaller i olika marker, eller ibland i olika brunnar inom samma chip. Detta indikerar att alla faktorer som påverkar crystal kärnbildning och tillväxt bör övervägas noga, såsom mor sprit sammansättning eller kristallisering kinetik (genom avdunstning banan). Som större kristaller gravering till högre upplösning, odlas idealiskt lämpligt stora kristaller. Processen för crystal kärnbildning och tillväxt kan följas med DLS mätningar. Justera laser fokus inuti den ~ 50 µm tunn kristallisering fack av chip kan vara utmanande och kan kräva noggrann manuell justering. Genom att använda brunnar djupare än 100 µm, var laser auto-justering genomförbart och pålitlig, sådan att flera brunnar skulle kunna övervakas genom automatiserade förvärv system.
Polyimid baserat röntgen marker producerar endast en låg bakgrund och vi visar lämpligheten av dessa enheter för rutin X-ray diffraction datainsamling genom att lösa strukturer för tre modell proteiner. Bästa upplösning erhålls i chip skilde sig, jämfört med tidigare uppnådda resolutioner, från betydligt större proteinkristaller och konventionell röntgen datainsamling. Detta kan bero på flera faktorer och ytterligare kristallisering skick optimering kan ytterligare förbättra diffraktion. Det var möjligt att samla in i situ diffraktion data upp till 1,8 Å upplösning tillämpa kristallen med mått mindre än 30 µm. Detaljerad analys av taumatin diffraktion data också insikter om strålskador. För att begränsa utöka av strålskador, bör endast en enda kristall utsättas per fack i ultrakalla enheten, eftersom spridningen av radikaler och i angränsande kristaller kan uppstå. För att förbättra hastigheten på datainsamling, bör det här automatiseras i framtiden.
På grund av crystal morfologi, i vissa fall kan en rekommenderad orientering uppstå. Detta var till exempel fallet med thioredoxin datamängden, där kristallerna hade en starkt rekommenderad orientering i förhållande till chip Fönstren. Även här kan vi samla in en komplett diffraktion datamängd. Om kristaller uppvisar en rekommenderad orientering i chip och särskilt om motsvarande utrymmegruppen har också en låg symmetri, då fullständighet datamängden bör övervakas under samlingen så att tillräcklig diffraktion mönster sockerrör vara samlas in.
Tid-löst studier med hjälp av dessa marker är direkt möjligt när med ljus inducerad reaktioner med en pump-probe-metoden. Polyimid folie ljustransmission för pump lasern behöver belysas och alternativt optiskt klara polyimid eller COC kunde användas. De nuvarande mikroflödessystem geometrierna tillåter inte för substrat blandas experiment efter kristaller odlas. Vi förväntar oss dock beskrivs röntgen chip fabrication protokollet också vara lämplig för sådan blandning design för både tid-löst röntgendiffraktion samt spridning metoder19.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av PIER utsäde fonden PIF-2015-46, BMBF beviljar 05K16GUA och 05K12GU3, och ‘Hamburg centrum för ultrasnabb Imaging – struktur, dynamik och kontroll av ärendet på den atomära skalan’ excellence klustret av Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG). Arbetet av författare knutet till centret för Free-elektron Laser vetenskap finansierades av Helmholtz Association genom orienterade programmedel. Synkrotron MX data samlades på beamline P14 drivs av EMBL Hamburg på PETRA III förvaring ring (DESY, Hamburg, Tyskland).
SU-8 3000 Series | MicroChem Corp. | SU-8 3000 | Photoresist |
PGMEA | Sigma-Aldrich | 484431 | Developer |
Isopropyl alcohol | Solvent | ||
Ethanol | Solvent | ||
Epoxy glue | UHU | Plus Schnellfest 5 min | Epoxy glue |
PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone |
Kapton foil | Dupont/ American Durafilm | HN grade, gauge 30 (7.5 μm) | polyimide foil |
APTS | Sigma-Aldrich | 440140 | Chemical |
GPTS | Sigma-Aldrich | 440167 | Chemical |
Cytop CTX-109AE | Asahi Glass Co. Ltd | Cytop CTX-109AE | Cytop fluoropolymer coating |
CT-Solv 100E | Asahi Glass Co. Ltd | CT-Solv 100E | Cytop fluoro-solvent |
HFE-7500 | 3M | Novec 7500 | Fluorinated oil |
AutoCAD | AutoDesk Inc. | AutoCAD | CAD Software |
Biopsy Punch | Harris | Uni-core 0.75 mm | |
Photo mask | JD Photo Data | ||
3 inch wafer | University Wafer | Silicon wafer | |
Mask aligner | SÜSS MicroTec | MJB4 | Mask aligner |
PDMS mixer | Thinky | ARE-250 | |
Plasma machine | Diener electronic | Zepto | |
Thaumatin | Sigma Aldrich | T7638 | Protein |
Glucose Isomerase | Hamton Research | HR7-102 | Protein |
Bis-Tris | Sigma Aldrich | B9754 | Chemical |
Sodium Tartrate | Merck | 106664 | Chemical |
Tris-HCl | Sigma Aldrich | 10812846001 | Chemical |
HEPES | Carl Roth | 6763.2 | Chemical |
Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | 208337 | Chemical |
Ammonium Sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Chemical |
EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Chemical |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 1064060250 | Chemical |
PEG1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | Chemical |
SPG buffer | Jena Bioscience | CSS-389 | Chemical |
SpectroLight600 | XtalConcepts | DLS Instrument | |
Nanodrop | Thermo Scientific | Spectrophotometer | |
Zentrifuge | Eppendorf | ||
Ultimaker2 | Ultimaker | 3D printer | |
Form2 | Formlabs | 3D printer | |
Amicon Filter | Sartorius Stedim | 0.2 µm filter | |
Tubing | Adtech Polymer Engineering Ltd | Bioblock/05 | PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter |
Syringes | BD | 309628 | 1ml Luer-Lock Tip |
Needle | Terumo Agani Needle | AN*2716R1 | 27Gx5/8" |