Il protocollo descritto nel presente documento è un metodo per la misurazione endoreduplicazione all’interno di tuberi di patata (Solanum tuberosum). Include passaggi di estrazione Plasmolisi e protoplasti per diminuire il rumore e detriti in analisi cytometric di flusso a valle.
Endoreduplicazione, la replicazione del genoma nucleare di una cellula senza citochinesi successiva, produce cellule con maggiore contenuto di DNA ed è associato con specializzazione, lo sviluppo e l’aumento nella dimensione del cellulare. Nelle piante, endoreduplicazione sembra facilitare la crescita e l’espansione di determinati tessuti e organi. Fra loro è il tubero di patata (Solanum tuberosum), che subisce una notevole espansione cellulare nell’adempiere la sua funzione di deposito di carboidrati. Così, endoreduplicazione può svolgere un ruolo importante in quanto sono in grado di ospitare questa abbondanza di carbonio tuberi. Tuttavia, i detriti cellulari derivanti da metodi di isolamento nucleare grezza di tuberi, metodi che possono essere utilizzati efficacemente con foglie, preclude la stima dell’indice endoreduplicazione tubero (EI). Questo articolo presenta una tecnica per la valutazione endoreduplicazione tubero attraverso l’isolamento di protoplasti mentre dimostrando risultati rappresentativi ottenuti da diversi genotipi e compartimenti stagni tessuti tubero. Le principali limitazioni del protocollo sono i costi di tempo e reagenti necessari per la preparazione del campione, come pure la durata relativamente breve dei campioni dopo la lisi dei protoplasti. Mentre il protocollo è sensibile alla variazione di tecnica, rappresenta un miglioramento rispetto ai tradizionali metodi di isolamento nucleare da queste grandi cellule specializzate. Possibilità di miglioramenti al protocollo come riciclaggio degli enzimi, l’uso di fissativi e altre alterazioni sono proposti.
Endoreduplicazione è il processo mediante il quale una cella rinuncia il tipico ciclo cellulare e subisce invece un corso alternativo di sviluppo costituito da ripetuti cicli di replicazione del DNA senza divisione cellulare. La cella risultante avrà un aumento del DNA dimensione contenuto e nucleare, che è pensato per svolgere un ruolo nella regolazione cellulare, espansione e specializzazione. Generalmente, un giro di endoreduplicazione (chiamato un endocycle) e il corrispondente aumento nel contenuto di DNA sono associati con più grande volume di cella, un’osservazione che ha precipitato la “teoria karyoplasmic” che ha aumentato il contenuto di DNA è necessario correttamente regolano una più grande, forse più complesso, cella1. Questo fenomeno è comune nelle piante superiori, avendo osservati in una gamma di tessuti, compresi quelli con strutturale/difensivo (tricomi)2,3, nutritiva (mais endosperma)4,5e lavandino/memorizzazione ( pericarpo di pomodoro; funzioni di tubero di patata)6,7,8 . Nel frutto, è stato suggerito che endoreduplicazione svolge un ruolo nel facilitare la rapida espansione del pericarpo, come dimostra la relazione negativa tra periodo inerente allo sviluppo endoreduplicazione e frutta per9. Per esempio le cellule con DNA contenuto fino a 512C (512 volte il genoma aploide) sono stati osservati nel pericarpo pomodoro8. Inoltre Chevalier et al (2014) hanno dimostrato che le alterazioni nell’espressione dei geni del ciclo cellulare possono condurre agli aumenti nei livelli endoreduplicazione entro il pericarpo che poi si traduce in più grande frutta10. Alterazione di geni promuovendo endoreduplicazione fornisce quindi un potenziale bersaglio per miglioramento della biomassa o resa attraverso allevamento vegetale o la manipolazione genetica. Tuttavia, tale miglioramento è subordinato a una maggiore comprensione delle cause e conseguenze della endoreduplicazione.
Endoreduplicazione è più spesso misurati tramite flusso cytometry per cui nuclei, rilasciati in tessuto greggio preparazioni11, sono incubati con un fluoroforo legante il DNA, come ad esempio propidio ioduro12 (PI). I campioni filtrati vengono quindi passati dal laser di un citometro a flusso, dove possa essere osservati lunghezze d’onda di emissione specifici per il fluoroforo. L’intensità di fluorescenza in ogni evento (cioè, nucleo) è direttamente correlata con il contenuto di DNA della particella. Pertanto, confrontando a uno standard conosciuto, può essere calcolato il contenuto di DNA relativo e assoluto delle celle in un dato campione. Endoreduplicazione indici (EI) sono determinati stabilendo il numero medio di endocycles per cella all’interno di un campione osservando il contenuto di DNA cellulare (C-valore) dove 1C è il contenuto di DNA di una cellula aploide (formula presentata nel passaggio 6.7 del protocollo). Per esempio, in un organismo diploide, contenuto di base del DNA delle cellule somatiche è 2 C. Se un campione ha poche cellule con 4C, corrispondente a un singolo round di endoreduplicazione o maggiore avrebbe un EI vicino a 0; Tuttavia se quasi tutte le cellule sono 4C EI sarebbe circa 1. Tuttavia, come più Arrotonda di endoreduplicazione è comuni a più alti valori osservati di EI piante può essere molto maggiore. Durante il calcolo di indici endoreduplicazione può essere relativamente semplice, che richiede che le abbondanze relative dei nuclei C-valori essere attendibilmente accertato, che è precluso in determinate specie e tessuti (tra cui tuberi di patata). È probabile che le differenze nella composizione di anatomia, chimica o parete cellulare cellulare13 causano questi campioni ad essere recalcitrante ai tipici preparati utilizzando una lama di rasoio per rilasciare i nuclei direttamente nel buffer appropriato che sono comunemente usati con tessuti come pericarpo di pomodoro, un modello per endoreduplicazione studi8.
Patata, l’esame della endoreduplicazione entro il tubero rimane limitata agli studi solo un paio, forse dovuti in parte alla mancanza di un protocollo affidabile come il sopraccennato preparazioni grezze producono risultati incoerenti. Mentre tali approcci funzionano bene per foglie i campioni di tubero esperienza grave degrado e un’abbondanza di rumore sotto forma di detriti, rendendo la differenziazione delle cime composto da nuclei con differenti valori di C quasi impossibili. Questo è forse dovuto le differenze nella composizione cellulare e una profusione di detriti cellulari all’interno delle cellule di tubero (ad es. amido-immagazzinare amiloplasti). Per superare questo ostacolo, recentemente abbiamo sviluppato un protocollo più affidabile per l’acquisizione di picchi distinguibili in citometria a flusso di tuberi di patata. La frequenza delle cellule all’interno di ogni picco quindi può essere utilizzata per il calcolo accurato endoreduplicazione livelli per genotipi diversi o diversi tessuti che compongono un tubero. Il protocollo, che impiega un antecedente di15 14,di protoplasti modificate estrazione metodo descritto in precedenza flusso cytometry11, ha mostrato una notevole variazione all’interno di parenti di patata, cultivar e tessuti16 . Qui vi presentiamo il protocollo nel dettaglio valutando EI in contesti di ploidia, tessuto e dimensione del tubero.
Il protocollo presentato qui fornisce i ricercatori con un mezzo per valutare endoreduplicazione all’interno di tuberi di patata, cui cellulare modificate contenuti e una maggiore dimensione della cellula apparentemente precludono altre preparazioni di citometria a flusso. Il protocollo si basa sulla generazione di protoplasti come mezzo per ridurre il rumore e detriti mantenendo integrità nucleare. In precedenza, i ricercatori hanno descritto preparazioni simili per campioni di cytometry di flusso particolarmente recalcitranti come pure utilizzato protoplasti di tubero per studiare una varietà di argomenti quali la patogenesi19,20. Tuttavia, a nostra conoscenza, nessuno hanno combinato l’uso di tali protoplasti di tubero con citometria a flusso per lo studio endoreduplicazione. Inoltre, abbiamo trovato l’uso dei protoplasti di essere più affidabile di tipiche preparazioni grezze come pure la tecnica utilizzata in due solo altri studi per valutare il tubero endoreduplicazione6,7. Qui discutiamo le carenze del protocollo, trabocchetti potenziali nella sua esecuzione e preparazione di campioni e risultati di un esperimento tipico che si impiega.
Nonostante l’utilità e la ripetibilità del protocollo tubero flusso cytometry, ha alcuni punti deboli che devono essere discussi. Per cominciare, il protocollo è tempo intensivo, che richiede due incubazioni overnight. Il protocollo prevede inoltre che alcuni reagenti costosi, in particolare la cellulasi e macerozyme. Inoltre, i preparativi sono altamente sensibili al fattore tempo, degradante entro poche ore, che possono limitare la velocità effettiva in un solo giorno, soprattutto se molti eventi sono desiderati. Infine, il protocollo, mentre affidabile, è sensibile a errori all’interno di preparazione del campione che sembrano causare danni ai nuclei e risultati di qualità inferiore. Ad esempio, la contaminazione microbica può verificarsi durante le fasi di generazione Plasmolisi e protoplasti (1 – 3.4) a causa di impropria tecnica asettica. Contaminazione del campione, mentre non sempre che preclude il successo di un campione, sembra diminuire drasticamente la qualità di istogrammi ottenuti, ancora una volta probabilmente dovuto ai danni dei nuclei.
Come affermato in precedenza, gli svantaggi principali del protocollo sono costi, tempo e sensibilità agli errori. I ricercatori potrebbero desiderare di prendere provvedimenti per attenuare ciascuno di questi. Per quanto riguarda il costo, i ricercatori intendono applicare il protocollo di molti campioni possono considerare modificando le concentrazioni negli enzimi e/o la durata della fase di digestione come tessuti differenti e genotipi possono variare nella capacità di risposta. Questo include la possibilità di filtraggio e riciclo l’ES che precedentemente è stata dimostrata ma non impiegato qui21. Per quanto riguarda il tempo, nella nostra osservazione, è possibile erogare con la prima incubazione (il passo di Plasmolisi) e ancora estrarre protoplasti; Tuttavia, l’integrità e la abbondanza soffrirà, che impatti negativamente i risultati. Per ridurre il deterioramento dei campioni i ricercatori possono considerare che alcuni approcci di citometria a flusso implicano l’uso di fissativi (ad es. formaldeide) per preservare l’integrità di esempio22. Questo può essere un mezzo utile per impedire il deterioramento sia consentire per esempio deposito piuttosto che del protoplasto concussione e flusso cytometry che accade lo stesso giorno come presentato. Un altro mezzo per prevenire il logorio dei nuclei potrebbe essere di includere un inibitore di nucleasi dell’ES e/o FBC; mentre 2-mercaptoetanolo non effettuato nessun cambiamenti notevoli durante lo sviluppo, altri inibitori non sono stati testati nel presente documento.
Nella nostra osservazione, la singola fase più critica è passo 4.4, la rimozione di tutte le soluzione di lavaggio Plasmolisi prima dell’aggiunta del buffer di citometria a flusso (FCB). Se anche un piccolo volume (< 10 µ l) resti, i campioni sono molto più propensi a essere degradato che può condurre ad un campione di povero o addirittura non riuscito. Ciò è probabilmente dovuto le impurità all'interno della soluzione di enzima (ad es. nucleasi, proteasi)23,24 che degradano rapidamente i nuclei durante i periodi di incubazione e il tempo tra le esecuzioni di campione, anche a basse concentrazioni. Un’altra considerazione importante è la durata delle fasi di incubazione PI e RNasi. Come indicato nel protocollo, i campioni non rimangono stabili per più di un paio d’ore dopo aggiunta del FCB così i ricercatori possono decidere di ridurre la durata di questi passi per ospitare ulteriori campioni o citometria a flusso lunga esecuzione derivanti dai nuclei Bassi concentrazioni. Questo richiede anche il ricercatore a considerare il compromesso tra il numero di eventi al campione e il numero totale di campioni da essere eseguito o considerare l’uso di fissativi come accennato in precedenza.
Differenze tra genotipi e tessuti
Per fornire rappresentante risultati del protocollo abbiamo progettato due semplici esperimenti per confermare la variazione precedentemente segnalati dal tessuto ed esaminare l’influenza della ploidia e genotipo. I risultati dell’esperimento tessuto dimostrano che il protocollo produce risultati riproducibili, come tessuto di midollo ancora una volta è stato trovato per avere il più alto EI. Abbastanza sorprendentemente tessuto di parenchima, che non era stata precedentemente valutato, ha avuto un valore EI simile a tessuto corticale e significativamente più basso di midollo. Questo è stato imprevisto come le cellule parenchima sono in genere più grande o di midollo o di cellule corticali, almeno a maturità. Una possibile spiegazione è che i tuberi (90 – 130 g) erano troppo immaturi per le cellule del parenchima, che costituiscono la maggior parte del volume di tubero a maturità, per completamente ampliato e ha raggiunto il loro massimo C-valori25. Questo potrebbe anche spiegare perché il dihaploid (VT_SUP_19) e il dihaploid raddoppiato (VT_SUP_19 x 4) dimostrato significativamente maggiore EI di tuberi Superior CV; mentre tuberi di approssimativamente uguali dimensioni sono state campionate da ciascun genotipo, la dimensione massima dei tuberi da VT_SUP_19 o il tetraploide isogeniche è molto più piccola di quella del progenitore. Pertanto, potrebbe essere che essi visualizzati maggiore EI semplicemente perché erano più grandi rispetto alla loro dimensione massima raggiungibile. In alternativa, la differenza può essere una conseguenza del complemento genetico che vt_sup_19 ricevuto dal suo progenitore tetraploide. Un’altra possibilità è che la riduzione di genomica che si sono verificati sull’estrazione della dihaploid dalla tetraploide può hanno smascherato alleli deleteri conseguente sforzo di tutto l’impianto, che ha anche dimostrato di contribuire a elevata EI26. Tuttavia, ciò dimostra che i ricercatori di attenta considerazione devono impiegare quando si seleziona tuberi e tessuti da utilizzare per il confronto dei valori EI, soprattutto fra i genotipi.
Applicazioni future
Il protocollo descritto in questo articolo fornisce ai ricercatori uno strumento importante per comprensione endoreduplicazione nella patata. Può consentire per studi nei componenti genetiche ed ambientali di endoreduplicazione, il corso di tempo di sviluppo attraverso tessuti tubero e valutazione della variazione naturale. In definitiva, endoreduplicazione può rendere un bersaglio promettente per miglioramento di patate, un’impresa che richiederà un mezzo affidabile di valutazione.
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata finanziata dal National Science Foundation Award numero 1237969, “Dipanare l’eterozigosi, composizione allelica e variazione numero di copia della patata” e USDA speciale Grant 2014-34141-22266 (University of Maine) a RV.
Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Conical tubes (50 ml) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Globe Scientific | 111558 | |
Microcentrifuge tubes (2 ml) | Globe Scientific | 111552 | |
Vacuum filtration unit (0.22µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
Vacuum filtration unit (0.45µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For smapling desired tissue |
Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
106um stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |