Количественный анализ сложности нейрональных дендритных арборизация у дрозофилы
Summary
Этот протокол фокусируется на количественный анализ сложности нейрональных дендритных арборизация (NDAC) у дрозофилы, который может использоваться для исследования дендритных морфогенеза.
Abstract
Дендриты разветвленной прогнозы нейрона, и дендритных морфология отражает синаптических Организации в ходе развития нервной системы. Дрозофилы личиночной нейрональных дендритных арборизация (da) является идеальной моделью для изучения морфогенеза нейронных дендритов и функции гена в развитии нервной системы. Есть четыре класса да нейронов. Класс IV является наиболее сложным с шаблоном ветвления, который охватывает почти всю площадь личиночной стенки тела. Мы ранее характеризуют эффект подавления Drosophila ortholog SOX5 класса IV нейрональных дендритных арборизация сложности (NDAC) с помощью четырех параметров: длина дендритов, площадь поверхности покрытия дендритов, Общее количество филиалов и разветвленной структуры. Этот протокол представляет собой процесс количественного анализа NDAC, состоящий из личинок рассечение, конфокальная микроскопия и процедур анализа изображений с помощью ImageJ программного обеспечения. Дальнейшее понимание да развития нервной системы и ее основные механизмы улучшения понимания нейрональных функции и предоставить подсказки о фундаментальных причин неврологические и нервной расстройств.
Introduction
Дендритов, которые являются разветвленные прогнозы нейрона, покрывают поле, которое включает сенсорные и синаптической входы нейрона от других нейронов1,2. Дендриты являются важным компонентом формирования синапсов и играть решающую роль в интеграции синаптических входов, а также распространение электрохимических стимуляции в нейрон. Дендритных арборизация (da) представляет собой процесс, по которому нейроны образуют новые дендритных деревья и ветви для создания новых синапсов. Развитие и морфология-Да, как филиал плотность и шаблоны группировки, результатом многоэтапного биологических процессов и тесной взаимосвязи нейронов функции. Цель настоящего Протокола заключается в предоставляют метод количественного анализа сложности нейрональных dendritric арборизация в дрозофила.
Сложность дендритов определяет синаптических типы, подключения и входы от партнера нейронов. Ветвящиеся структуры и плотность дендритов участвуют в обработке сигналов, которые сходятся на дендритных поле3,4. Дендриты имеют гибкость для корректировки в области развития. Например синаптических сигнализации сказывается на организации дендритов соматосенсорные нейрон в ходе этапа развития и в развитой нервной системой5. Создание соединения нейронов опирается на морфогенеза и созревания дендритов. Пороки развития дендритов ассоциируется с нарушениями функции нейронов. Исследования показали, что аномалия да нейрон морфогенеза может способствовать этиологии множественные нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Гентингтона (HD), и Лу Гериг болезнь / Боковой амиотрофический склероз (ALS)6,,78. Синаптических изменения появляются на ранней стадии AD, в концерте с спад и ухудшение нейрон функция7,8. Однако специфика как дендритов патологии способствует патогенез этих нейродегенеративных заболеваний остается труднодостижимой.
Развития дендритов регулируется гены, которые кодируют сложную сеть регуляторов, например Wnt семейство белков9,10, факторов транскрипции и лигандами на поверхности рецепторы клеток11,12 . Дрозофилы да нейроны состоят из четырех классов (класса I, II, III, IV), из которых класса IV да нейроны имеют самые сложные структуры ветвления и использовали в качестве мощной экспериментальной системы для лучшего понимания морфогенеза13, 14. Во время ранних морфогенеза гиперэкспрессия или RNAi сайленсинга генов в класс IV да нейронов привести к изменениям в разветвленной структуры и дендритов обрезка13. Важно разработать практический метод количественного анализа нейрональных дендритных арборизация.
Ранее мы показали, что молчание Drosophila ortholog SOX5, Sox102F, привело к коротких дендритов нейронов да и уменьшение сложности в классе IV да нейронов15. Здесь мы представляем процедуры количественного анализа для нейронов дендритных арборизация сложности (NDAC) у дрозофилы. Этот протокол, взято из предыдущего описывается методология, предоставляет краткое метод для анализа развития да сенсорных нейронов. Это иллюстрирует надежные изображения маркировки и да нейрон в третьего возраста личиночной стенки тела16,17,18,19. Это ценный протокол для исследователей, которые хотят исследовать NDAC и развития различия в естественных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Дендритов, которые иннервируют эпидермис являются области входных нейронов, и их морфологии определить, каким образом информация поступает и обрабатывается индивидуальных нейронов. Развития дендритов морфология отражает гена модуляции дендритов Организации. Нейрон личиночной да …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Уильяма а. Eimer для визуализации технической помощи. Эта работа была поддержана Фондом Cure-Альцгеймера [в R.E.T], Национальный институт здравоохранения [R01AG014713 и R01MH60009 для R.E.T; R03AR063271 и R15EB019704 а.л.] и Национальный научный фонд [NSF1455613 а.л.].
Materials
| Phosphate buffered saline(PBS) | Gibco Life Sciences | 10010-023 | |
| TritonX-100 | Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| Paraformaldehyde(PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent | Dow Corning Corportation | 3097366-0516;3097358-1004 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fingernail polish | CVS | 72180 | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Petri dish | Falcon | 353001 | |
| Forceps | Dumont | 11255-20 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5611 | |
| Insect Pins | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6082-25 | |
| Microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | 15-188-52 |
References
- Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
- MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
- Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons. Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).
- Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
- Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases. BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).
- Baloyannis, S. J. Dendritic pathology in Alzheimer’s disease. J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).
- Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer’s disease. Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development. Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
- Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Sears, J. C., Broihier, H. T. FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons. Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).
- Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment. Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).
- Misra, M., et al. A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis. G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).
- Emoto, K., et al. Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons. Cell. 119 (2), 245-256 (2004).
- Olesnicky, E. C., et al. Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis. G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
- Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).
- Copf, T. Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development. Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).
- Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 103 (2013).
- Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. Full reversal of Alzheimer’s disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3. J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
