Adaptation de l’hybridation prise de protéines associées à la chromatine pour la protéomique pour les cellules de mammifères
Summary
Il s’agit d’une méthode pour identifier de nouvelles protéines interagissant avec ADN loci cible spécifique, en s’appuyant sur la capture de séquences spécifiques de chromatine réticulée pour analyses protéomiques ultérieures. Aucune connaissance préalable de protéines de liaison potentielle, ni modifications cellulaires ne sont nécessaires. Initialement développé pour la levure, la technologie a été adaptée pour les cellules mammifères.
Abstract
La capture de l’hybridation des protéines associées à la chromatine de technologie protéomique (HyCCAPP) a été initialement développée pour découvrir de nouvelles interactions ADN-protéine dans la levure. Il permet l’analyse d’une zone cible d’intérêt sans besoin de connaissances préalables sur les protéines probables lié à la région cible. Ceci, en théorie, permet HyCCAPP à utiliser pour analyser n’importe quelle région génomique d’intérêt, et il fournit suffisamment de souplesse pour travailler dans les systèmes cellulaires différentes. Cette méthode n’est pas destinée à étudier des sites de liaison connue des facteurs de transcription, une tâche mieux adaptée à l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et les méthodes de type puce. La force de HyCCAPP réside dans sa capacité à explorer des régions d’ADN pour lesquels il existe peu ou aucune connaissance sur les protéines lié à elle. Il peut également être une méthode pratique pour éviter les biais (présent dans la puce comme méthodes) introduits par un enrichissement de la chromatine à base de protéines en utilisant des anticorps. Potentiellement, l’HyCCAPP peut être un outil puissant pour découvrir véritablement nouvelles interactions ADN-protéines. A ce jour, la technologie a été principalement appliquée aux cellules de levure ou de séquences répétées de copie élevée dans les cellules de mammifères. Pour devenir un outil puissant que nous envisageons, HyCCAPP approches doivent être optimisées pour capturer efficacement les loci de l’exemplaire unique dans les cellules de mammifères. Ici, nous présentons notre adaptation de la levure initiale HyCCAPP protocole de lignées cellulaires humaines de capture et montrent que les régions de chromatine exemplaire unique peuvent être efficacement isolées avec ce protocole modifié.
Introduction
Au cours de la dernière décennie, il a vu une amélioration spectaculaire des technologies de séquençage, ce qui permet l’étude d’un large éventail des génomes dans un grand nombre d’échantillons et avec une résolution étonnante. Le Consortium de l’Encyclopédie des éléments de l’ADN (Encoder), un effort de plusieurs établissement à grande échelle mené par le National Human Genome Research Institute de la National Institutes of Health, a permis de mieux comprendre comment les facteurs de transcription et autres protéines régulatrices lient à et d’interagissent avec le génome. L’effort initial caractérise les interactions ADN-protéines spécifiques, tels qu’évalués par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour plus de 100 connus de protéines de liaison à l’ADN1. Les méthodes alternatives comme la DNase empreinte2 et formaldéhyde assistée isolement des éléments régulateurs (FAIRE)3 ont également été utilisés pour localiser les régions spécifiques du génome en interaction avec les protéines, mais avec la restriction évidente qui ces approches expérimentales n’identifient pas les protéines qui interagissent. Malgré les efforts considérables au cours des dernières années, aucune technologie n’est apparu qu’efficace permet la caractérisation complète des interactions protéine-ADN en chromatine et l’identification et la quantification des protéines associées à la chromatine.
Pour répondre à ce besoin, nous avons développé une approche originale qui nous qualifiées de protéines de Hybridization Capture of Chromatin-Associated pour la protéomique (HyCCAPP). Initialement développée en levure4,5,6, l’approche isole des régions de chromatine réticulée d’intérêt (avec des protéines de liés) à l’aide de capture de séquences spécifiques hybridation. Après l’isolement des complexes protéine-ADN, approches telles que la spectrométrie de masse peuvent être utilisés pour caractériser l’ensemble des protéines liées à la séquence d’intérêt. Ainsi, la HyCCAPP peut être considéré comme une approche impartiale pour découvrir de nouvelles interactions ADN-protéine, en ce sens qu’il ne s’appuie pas sur les anticorps et il est complètement agnostique sur les protéines qui se trouvent. Il existe d’autres approches capables de découvrir roman interaction ADN protéines7, mais s’appuient plus sur puce comme méthodes8,9,10, plasmide insertions11,12, 13,14, ou régions à haute copie numéros15. En revanche, HyCCAPP peut être appliqué aux régions de multi – et unique-copy, et il ne nécessite aucune information préalable sur les protéines dans la région. En outre, bien que certaines des méthodes mentionnées ci-dessus ont des caractéristiques précieuses, notamment en évitant la nécessité pour des réactions de réticulation ADN-protéine, la caractéristique unique de HyCCAPP est qu’il peut être appliqué aux régions de la simple copie de non modifié cellules et sans aucune connaissances préalables sur les protéines de liaison putatif ou anticorps disponibles.
À ce stade, HyCCAPP a surtout été appliquée à l’analyse des différentes régions génomiques de levure4,5,6et a récemment été utilisée pour analyser les interactions protéine-ADN dans l’ADN de l’alpha-satellite, une région de répétition dans le génome humain16. Dans le cadre de nos travaux en cours, nous avons adapté la méthode de capture hybridation initialement développée pour la chromatine de levure être applicable à l’analyse des cellules humaines et vous présente ici un protocole modifié qui permet la capture sélective de la simple copie cible régions du génome humain avec des rendements similaires à nos premières études chez les levures. Ce nouveau protocole optimisé permet maintenant l’adaptation et l’utilisation de la technologie pour interroger des interactions protéine-ADN dans le génome humain, à l’aide de la spectrométrie de masse ou d’autres approches analytiques.
Il est important de souligner que la méthode HyCCAPP est destinée à l’analyse des régions cibles spécifiques et n’est pas encore adaptée aux analyses du génome. La technologie est particulièrement utile lorsqu’il s’agit avec les régions pour lesquelles il y a des informations limitées sur les protéines qui interagissent, ou lorsque vous souhaitez une analyse plus détaillée et approfondie des protéines qui interagissent dans un locus de génome spécifique. HyCCAPP est destiné à découvrir les protéines de liaison à l’ADN, mais pas caractériser avec précision les sites de fixation de protéines spécifiques dans l’ADN génomique. Dans son implémentation actuelle, la méthode ne fournit pas d’informations sur les séquences d’ADN ou des motifs pour protéines individuelles. Donc, il bien complète des technologies existantes telles que FAIRE et peut permettre l’identification des protéines liant le roman en régions génomiques identifiés par une analyse initiale de la FAIRE.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode HyCCAPP décrite ici a plusieurs caractéristiques uniques qui en font une approche puissante pour découvrir les interactions ADN-qui resteraient autrement insaisissables. La nature du processus donne HyCCAPP la possibilité de travailler dans divers organismes et régions du génome. Il s’agit d’une méthode, mais qui a plusieurs limites à prendre en considération.
HyCCAPP est une méthode qui évite toute modification de la cellule afin qu’il peut potentiellement être a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les NIH subventions P50HG004952 et R01GM109099 à Mo.
Materials
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyze capture oligonucleotids | |
| PairFold | UBC | Analyze interactions | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller bottle | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller system | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digital sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magnet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridization oven | SciGene | ||
| Tube shaker and rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 |
References
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