Nukleinsyre nedbrydning i arkivering væv, tumor heterogenitet og mangel på frisk frosset væv prøver kan negativ indflydelse på kræft diagnostic services i patologi laboratorier verden over. Dette manuskript beskriver optimering af et panel af biomarkører ved hjælp af en multiplex magnetisk bead assay for at klassificere brystkræft.
Nukleinsyre nedbrydning i arkivering væv, tumor heterogenitet og mangel på frisk frosset væv prøver kan negativ indflydelse på kræft diagnostic services i patologi laboratorier verden over. Gen amplifikation og udtryk diagnostiske test ved hjælp af arkivmateriale eller materiale, der kræver transport til servicering laboratorier, har brug for en mere robust og præcis test tilpasses aktuelle kliniske arbejdsgange. Vores research team optimeret brug af Invitrogen™ QuantiGene™ Plex Assay (Thermo Fisher videnskabelige) at kvantificere RNA i arkivmateriale ved hjælp af forgrenede-DNA (bDNA) teknologi på Luminex xMAP® magnetiske perler. Gen expression analysen beskrives i dette håndskrift er en roman, hurtig, og multiplex metode, der kan præcist klassificere brystkræft i de forskellige molekylære undertyper, udelade subjektivitet fortolkning iboende imaging teknikker. Hertil kommer, på grund af den lave indgang på materiale kræves, heterogene tumorer kan være laser microdissected ved hjælp af hæmatoxylin og Eosin (H & E) farves sektioner. Denne metode har en bred vifte af mulige applikationer herunder tumor klassifikation med diagnostiske potentiale og måling af biomarkører i flydende biopsier, der ville give bedre patienthåndtering og sygdomsovervågning. Derudover er kvantitativ måling af biomarkører i arkivalier nyttige i onkologi forskning med adgang til biblioteker af klinisk kommenteret materiale, hvor retrospektive undersøgelser kan validere potentielle biomarkører og deres kliniske resultater korrelation.
Optimering af RNA baseret assays ved hjælp af formalin-fast paraffin-embedded (FFPE) arkivalier er udfordrende på grund af variation i kirurgisk væv forarbejdning og nedbrydning af RNA forårsaget af formalin anvendes til væv integritet bevarelse1, 2. For at overvinde begrænsningen af udfører præcis gen expression undersøgelser fra arkivalier, brugte vores gruppe bDNA multiplex magnetisk bead assay. I stedet for enzymatisk forstærkning af en target skabelon bruger bDNA teknologi hybridisering af specifikke sonder og forstærkning af en reporter signal3. Den korte anerkendelse sekvenser af opsamling og registrering af sonder er designet til at krydse til korte brudstykker af target RNA4. Desuden overvinder brug af væv homogeniseret som direkte råvaren i denne analyse, de uundgåelige tab af RNA, at resultaterne fra assays kræver forudgående RNA ekstraktion og oprensning. Signal forstærkning, brug af kort anerkendelse sekvenser og udelukkelse af en rensning skridt, bidrage til at reducere i tekniske variation af analysen. Teknologien giver mulighed for at multiplex assay (op til 80 RNA mål) og måle udtryk af et panel af mål fra lav materiale input. Denne protokol beskriver forberedelsen og farvning af vævsprøver for laser microdissection. Farvning på membran dias lette billeddannelse af tumor og histologiske arkitektur at levere nøjagtige udvalg og profilering af: (1) tumor og normale kanaler i brystvæv, og (2) den maligne celler kloner i heterogene tumorer.
Molekylær klassificering af brystkræft er en proces, der afhører molekylære markører for at kategorisere patient tumorer i tre molekylære klasser, dvs., luminale, human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2)-beriget og basal undertype. Undertypen HER2-beriget er veldefinerede, med højt udtryk af HER2-receptoren, på grund af ERBB2 gen amplifikation, kombineret med lav eller fraværende østrogen receptor (ER) og progesteron receptor (PgR). Den luminale subtype er generelt positive for ER og basal subtype er i generelle negative for de tre receptorer (HER2, ER, PgR), og betydeligt overlap med triple negative breast cancer (TNBC) diagnostisk undertype5,6. Andre markører bruges til at bestemme epitel og mesenchymale egenskaber. Fibronektin (FN1) er en hovedbestanddel af bryst væv mesenchymale rum. Øget FN1 udtryk er ledsaget af højt Ki67 farvning, og viser en signatur for en mere invasive tumor7,8 og er forbundet med metastaser9. Det er interessant, blev FN1 fundet for at være til stede i microvesicles stammer fra tumorceller, som inducerede aktivering af mitogenic signaler i modtagerens fibroblaster10. Derfor, omløb microvesicles såsom exosomes er en potentiel markør for tidlig påvisning eller metastaser og tilbagefald11.
Tumor område udvalg for bryst kræft transcriptional subtyping er jævne udført af macrodissection12,13. For at overvinde væv heterogenitet og øge følsomheden, har vi kombineret klassisk væv farvning med multiplex Molekylær profilering metoder. Som et bevis for princippet, er to særskilte bryst kræft kloner defineret af deres epitelial mesenchymale signatur og metastatisk potentiale. Arbejdsgang af den beskrevne protokol kan let oversættes til den aktuelle opsætning af kliniske og bruges til selektivt isolerer og karakteriserer væv undertyper ved hjælp af målrettede mRNA profilering.
En perle-baserede multiplex bDNA assay var optimeret til at kvantificere genekspression på nedbrudt RNA stammer fra FFPE bryst kræft væv og normal brystet kanaler. Optimering af analysen, normalisere involveret udvikle en algoritme til at klassificere brystkræft tumorer i luminale og basal undertyper udnytter 8 velkendte biomarkører og 5 potentielle gener. Yderligere oplysninger om datanormalisering blev gjort ved hjælp af permutationer af normalisere gener. Udvælgelsen af de normalisere gener var baseret på den bedste forudsigelse af receptor status ved hjælp af Luminal/Basal klassificeringen gener. For at klassificere Luminal/Basal undertyper fra FFPE væv, var normalisere gener valgt Beta-actin (ACTB), glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) og Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
Metoden kan være tilpasset til brug i andre diagnostiske og forskningsområder efter passende udvalg af den normalisere gen sæt. En vigtig anvendelse af denne metode i forskningssektoren er måling af biomarkører i arkivalier, der er godt kommenteret med kliniske resultater. Dette kunne validere potentielle prædiktive markører i retrospektive undersøgelser, hurtigt og præcist og undgå langsigtede Fremtidsstudier afventer sygdomsfri overlevelse og samlet overlevelsesdata. I øjeblikket er vores gruppe ved at undersøge brugen af analysen at opdage receptor-positiv exosomes, som kræver udvikling af en ny algoritme ved hjælp af alternative normalisere gener for yderligere oplysninger om datanormalisering. Brugen af flydende biopsier og robust gen expression assays vil give høj overførselshastighed multiplex assays tilpasset til patienthåndtering under behandlingen, og give et middel til at følge behandling effektivitet, potentielle tilbagefald på grund af modstand mod terapi, og den metastatisk kapacitet af tumor.
Denne metode også har en bred vifte af mulige applikationer i diagnosticering af tumorer og er tilpasset den aktuelle diagnostiske arbejdsproces. De vigtigste fordele ved denne metode i feltet diagnostiske omfatter: (1) gennemførelsen af høj overførselshastighed assays, (2) undtagen subjektivitet og tvetydige resultater med oprindelse fra image-baserede målinger, (3) nøjagtig påvisning af flere mål samtidigt, hvilket forbedrer nøjagtigheden og minimere brugen af dyrebare patientprøver, og (4) ingen krav om højt specialiserede faciliteter og menneskelige ressourcer. Optimeret prøvetagning proces, sammen med lav input materiale kræves til perle-baserede multiplex analysen, giver mulighed for yderligere undersøgelse af tumor heterogenitet; ved hjælp af laser microdissection til at adskille flere foci af maligne væv fra sektionen samme patient, er det muligt at sammenligne flere genekspression mellem dem samt med matchede normale væv (figur 4). Lav materialeforbruget er afgørende for diagnostisk program på tumor biopsier, der giver begrænset tumor væv. Analysen evne til at måle genekspression fra nedbrudt RNA prøver giver mulighed for nem transport af prøver til analyse i en institution eller til servicering laboratorier. Derudover var hele afsnittet analyse også muligt ved hjælp af H & E farves materiale (figur 1).
For succesen med denne protokol, er det bydende nødvendigt at: (1) sikre korrekt prøvetagning af tumor site/s, der er mængden for analysen, og (2) udvikle godt optimeret og validerede data normalisering algoritmer, for hvert gen udtryk panelet og/eller individuelle prognostiske eller forprogrammeret biomarkører. Den tidligere afhænger den tekniske erfaring af tekniker/videnskabsmand udføre prøveudtagning. Det anbefales at tage en ekstra kerne og forberede en væv microarray (TMA) i det samme format af multiplex magnetisk bead assay (96-brønds format). Dette vil give et arkiv af tumor websteder som en kopi af prøver anvendes til den RNA-baserede assay. TMAs kan også vurderes med andre teknikker til opfølgende forskning eller validering af resultaterne. Udvikling af normalisering algoritmer er afhængig af materialet undersøges og normalisere gener valgt til normalisering. Forskellige paneler af normalisering gener er udvalgt på grundlag af niveauet og variabiliteten af udtryk i prøven analyseres og dette varierer mellem kræft væv fra forskellige oprindelser, exosomes fra plasma, eller cirkulerende tumorceller. Validering af analysen omfatter prøve behandling da forskellige præparater vil også resultere i forskellige normalisering algoritmer.
For at opsummere, brugen af bDNA teknologi i kombination med magnetisk bead teknologi og udvælgelse af den rette panel af target gener, vil give den ekstra fordel at måle genekspression direkte i væv lysates stammer fra små mængder af patient materiale, herunder microdissected materiale, exosomes, og cirkulerende tumorceller. Tillæg til påvisning af tumor heterogenitet har korrekt brug af paneler potentiale til at opdage tumor stammer exosomes for tidlig diagnosticering og tidlig påvisning af tilbagefald. Da der er ikke behov for en nukleinsyre amplifikation skridt, signal forstærkning ved hjælp af bDNA teknologi, kombineret med perle-baserede multiplex, måler flere genekspression i klinisk kommenteret arkivalier og give en ressource for biomarkør validering.
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet var støttet af (1) et bryst kræft projekt legat (2014-2016) finansieret af handlingen for Breast Cancer Foundation og ALIVE 2013 gennem forskning, Innovation og udvikling Trust (RIDT) for University of Malta, (2) det medicinske fakultet & Kirurgi, University of Malta og (3) projekt ACT finansieres af Malta Rådet for Science & Technology gennem FUSION: The R & I teknologi udvikling program 2016. Offentliggørelsen af dette manuskript understøttes gennem Jove-Luminex grant.
Microtome | Leica | RM2235 | |
Heamatoxylin Mayer's | Sigma | MHS16-500mL | |
Eosin Y Aquaeous solution | Sigma | HT110216-500mL | |
Normal Rabbit Serum | Monosan | MONX10963 | Working dilution: 1/40 |
Biotinylated Rabbit anti-mouse | Dako | E0354 | Working dilution: 1/200 |
ER antibody (6F11) | Vector Laboratories | VPE614 | Working dilution: 1/45 |
HER2 antibody (CB11) | Novocastra | CB11-L-CE | Working dilution: 1/325 |
Ki67 antibody (MIB-1) | Dako | M7240 | Working dilution: 1/500 |
Avidin Biotin Complex kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope | Nikon | Ti-E | 4x, 10x, 20x and 40x objectives |
Laser Microdissection membranes | Molecular Machines &Industries | S0103 | |
mmi CellCamera 1.4 | Molecular Machines &Industries | MX4285c-ACK07 | |
mmi Cellcut Plus | Molecular Machines &Industries | ||
Diffuser caps | Molecular Machines &Industries | 50210 | |
mmi Celltools Software v.4.01rcl | Molecular Machines &Industries | ||
Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355000038 | |
1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670522 | |
96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670565 | |
Labnet Vortemp 56 Shaking incubator | Labnet | 52056A-220 | |
LX200 100/200 | Luminex | Magnetic bead analyser | |
Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit – FFPE Tissues | ThermoFisher Scientific | QS0109 | |
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation) | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
Thermaseal RTS Sealing Film | Thermaseal | 765246 | |
Hand-Held Magnetic Plate Washer | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit | Affymetrix/Panomics | QS0517 | |
Proteinase K (50µg/µL) | ThermoFisher Scientific | 14622 | |
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets | ThermoFisher Scientific | Various | |
Multi Speed Vortex | Kisker Biotech | MSV-3500 | |
Sonicator | Silvercrest | ||
RNASEZAP | Sigma | R2020-250ML | |
Aluminium 96-well plate seal | Sigma | Z721549-100EA | |
Temperature Validation Kit | ThermoFisher Scientific | QS0517 | |
RapidMiner Studio Community 7.1.001 | RapidMiner | Data Science Platform | |
Hybridisation oven | Hybaid (Thermo Scientific) |