חומצת גרעין השפלה ארכיוני רקמת הגידול הטרוגניות, חוסר דגימות רקמה קפוא טרי עלולה להשפיע לרעה על שירותי אבחון סרטן במעבדות פתולוגיה ברחבי העולם. כתב יד זה מתאר אופטימיזציה של פאנל של סמנים ביולוגיים שימוש assay חרוז מגנטי מולטיפלקס לסווג סרטן השד.
חומצת גרעין השפלה ארכיוני רקמת הגידול הטרוגניות, חוסר דגימות רקמה קפוא טרי עלולה להשפיע לרעה על שירותי אבחון סרטן במעבדות פתולוגיה ברחבי העולם. ג’ין הגברה וביטוי אבחון בדיקה באמצעות חומר ארכיוני או חומר הדורש תחבורה כדי מתן שירות מעבדות, צריך מבחן מדויק ועמיד יותר הותאם זרימות העבודה הקלינית הנוכחית. צוות המחקר שלנו ממוטב לשימוש Invitrogen™ QuantiGene™ Plex Assay (Thermo ופישר סיינטיפיק) לכמת RNA בחומר ארכיוני באמצעות טכנולוגיה של הקנים-דנ א (bDNA) על Luminex xMAP® beads מגנטי. ביטוי גנים וזמינותו המתואר בכתב היד הוא הרומן, מהיר, מולטיפלקס שיטה זאת במדויק לסווג סרטן השד לתוך תת מולקולריים שונים, תוך השמטת את הסובייקטיביות של פרשנות הטמונה בטכניקות הדמיה. בנוסף, בשל קלט נמוך של החומר הנדרש, הטרוגניות גידולים יכולים להיות microdissected לייזר באמצעות Hematoxylin, סעיפים מוכתמים אאוזין (H & E). בשיטה זו יש מגוון רחב של יישומים אפשריים כולל סיווג הגידול עם פוטנציאל אבחון ומדידה של סמנים ביולוגיים ביופסיות נוזלי, אשר תאפשר ניהול החולה טוב יותר וניטור מחלות. בנוסף, המדידה כמותית של סמנים חומר ארכיוני שימושית במחקר אונקולוגיה עם גישה לספריות של חומר מבואר קלינית, שבו לימודי רטרוספקטיבי יכול לאמת סמנים ביולוגיים פוטנציאליים והתוצאה הקלינית שלהם המתאם.
אופטימיזציה של RNA המבוסס על מבחני באמצעות פורמלין-קבוע-מוטבע פרפין (FFPE) חומר ארכיוני הוא מאתגר עקב השתנות כירורגית ברקמה, השפלה של RNA הנגרמת על ידי פורמלין משמש לרקמות שלמות שימור1, 2. כדי להתגבר על המגבלה של ביצוע מחקרים ביטוי גנטי מדויק של חומר ארכיוני, הקבוצה שלנו משמש bDNA חרוז מגנטי מולטיפלקס וזמינותו. במקום הגברה אנזימטי של תבנית היעד, הטכנולוגיה bDNA משתמש הכלאה של הגששים ספציפיים, הגברה של האות כתב3. רצפי זיהוי קצר הגששים לכידת וזיהוי נועדו hybridize כדי קצר שברי היעד רנ א4. בנוסף, השימוש של רקמת homogenates החומר המוצא הישיר הזה assay, מתגבר על אובדן בלתי נמנע של RNA הנובעת מבחני דרישה מוקדמת RNA מיצוי וטיהור. הגברה של האות, השימוש של רצפי זיהוי קצר והכללת צעד טיהור, לתרום הקטן בוריאציה טכני של וזמינותו. הטכנולוגיה מספק את האפשרות מגה-פלקס וזמינותו (מטרות RNA עד 80) ולמדוד את הביטוי של פאנל של מטרות מחומר נמוך קלט. פרוטוקול זה מתאר ההכנה מכתים של דגימות רקמה עבור לייזר microdissection. צביעת בשקופיות ממברנה להקל על ההדמיה של הגידול, אדריכלות היסטולוגית לספק בחירה מדויקת, יצירת פרופילים של: (1) הגידול ואת צינורות רגילים ברקמת השד (2) תא ממאיר שיבוטים בתוך גידולים הטרוגנית.
סיווג מולקולרית של סרטן השד הוא תהליך חוקר סמנים מולקולריים לסווג המטופל גידולים לתוך שלוש מחלקות מולקולרית, קרי, luminal, אנושי גורם הגדילה באפידרמיס קולטן 2 (HER2)-סוג של מועשר, ואת הבסיס. המשנה מועשרת HER2 היא מוגדרת היטב, עם ביטוי גבוהה של הקולטן HER2, עקב ERBB2 ג’ין הגברה, בשילוב עם נמוך או נעדר קולטן אסטרוגן (ER), קולטני פרוגסטרון (PgR). המשנה luminal הוא בדרך כלל חיובי עבור מיון המשנה הבזליים הם כללי שלילי עבור שלושה קולטנים (HER2, המיון, PgR) וכן באופן משמעותי חופף עם5,6סוג של אבחון סרטן (TNBC) חזה משולש שלילי. סמנים אחרים משמשים כדי לקבוע מאפייני האפיתל, mesenchymal. Fibronectin (FN1) הוא מרכיב העיקרי של תא mesenchymal של רקמת השד. הביטוי FN1 מוגברת מלווה Ki67 גבוהה מכתים, ואת מראה חתימה עבור7,גידול פולשניים יותר8 והיא קשורה עם גרורות9. מעניין, FN1 נמצאה להיות נוכח שמקורן תאי הגידול, שהביאה הפעלה של אותות mitogenic fibroblasts הנמען10. שלפוחיות זעירות. לפיכך, ונע שלפוחיות זעירות כמו exosomes הם סימן פוטנציאל לגילוי מוקדם או גרורות, נסיגה11.
בחירה באזור הגידול עבור subtyping תעתיק סרטן השד שהדו-שיח בוצע על ידי macrodissection12,13. כדי להתגבר על רקמות הטרוגניות להגביר את רגישות, שילבנו באופן אמין רקמה קלאסית מכתים עם מולטיפלקס שיטות פרופיל מולקולרית. מהווה הוכחה של עיקרון שני שכפולים סרטן השד ברורים שהוגדרו ע י חתימה mesenchymal אפיתל ופוטנציאל גרורתי שלהם. זרימת העבודה של הפרוטוקול המתואר יכול להיות בקלות לתרגם את ההתקנה הקלינית הנוכחית, נהגה באופן סלקטיבי לבודד ולאפיין סוגי רקמות באמצעות פרופיל mRNA יישוב.
Assay המבוסס על חרוז bDNA מולטיפלקס אופטימלי לכמת ביטוי גנים ב- RNA מפורק נגזר FFPE רקמת סרטן השד ו צינוריות השד רגיל. מיטוב וזמינותו, מעורבת בפיתוח אלגוריתם לסיווג גידולים של סרטן השד בתת luminal, הבסיס ניצול סמנים ביולוגיים ידועים 8 ו-5 פוטנציאליים נרמול גנים. נירמול בסיס נתונים נעשה באמצעות צירופים של גנים תהליך. הבחירה של גנים תהליך התבססה על התחזית הכי טובה של קולטן מצב באמצעות הגנים המסווג Luminal/Basal. כדי לסווג תת Luminal/Basal רקמות FFPE, הגנים תהליך שנבחרו היו בטא-אקטין (ACTB), גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH), ו- 1 Phosphoribosyltransferase Hypoxanthine (HPRT1).
השיטה ניתן להתאים לשימוש באבחון אחרים ללא שטחי מחקר בעקבות מבחר סביר של קבוצת גנים תהליך. יישום חשוב אחד של שיטה זו בתחום המחקר הוא המדד של סמנים ביולוגיים חומר ארכיוני מסומן היטב עם התוצאות הקליניות. זה יכול לאמת את סמני חזוי פוטנציאל במחקרים רטרוספקטיבית, במהירות ובדייקנות, ולהימנע מחקרים ארוכי טווח פוטנציאליים ממתין הישרדות ללא מחלה, נתוני ההישרדות הכוללת. כיום הקבוצה שלנו היא חוקרת את השימוש וזמינותו לזהות קולטן חיובי exosomes, אשר דורשת התפתחות באמצעות אלגוריתם חדש חלופי נרמול גנים של נרמול נתונים. השימוש ביופסיות נוזלי מבחני ביטוי גנים חזקים מאפשרות תפוקה גבוהה מבחני מולטיפלקס הותאם לניהול המטופל במהלך הטיפול, לספק אמצעי לעקוב אחר יעילות הטיפול, נסיגה פוטנציאליים בשל התנגדות לטיפול, ו גרורות קיבולת של הגידול.
שיטה זו גם יש מגוון רחב של יישומים אפשריים באבחון של גידולים ומותאם לזרימת העבודה אבחון הנוכחית. היתרונות העיקריים של שיטה זו בתחום האבחון כוללות: (1) יישום מבחני תפוקה גבוהה, (2) למעט הסובייקטיביות ותוצאות דו-משמעית שמקורם מדידות מבוססת תמונה, (3) איתור מדויק של מטרות מרובות בו זמנית, אשר לשפר את הדיוק ואת לצמצם את השימוש יקר סבלני, ודוגמאות (4) אין דרישה עבור מתקני מאוד מיוחדים ומשאבי אנוש. תהליך דגימה ממוטבת, יחד עם קלט נמוך של החומר הנדרש עבור מבוסס-חרוז מולטיפלקס וזמינותו, מאפשר בהמשך החקירה של הגידול הטרוגניות; באמצעות לייזר microdissection להפרדת במדויק מוקדים מרובים של רקמה ממאירה מתוך המקטע החולה באותו, זה אפשרי להשוות בין מספר גנים ביניהם, כמו גם עם תואם הרקמות (איור 4). קלט גשמי נמוך הוא חיוני עבור יישום אבחון הגידול ביופסיות המספקים רקמת הגידול מוגבל. הקיבולת של וזמינותו למדוד ביטוי גנים מדגימות RNA מפורק מאפשר תחבורה נוחה של דגימות לבדיקה בתוך מוסד או מתן שירות מעבדות. בנוסף, ניתוח שכל האזור היה גם אפשרי באמצעות H & E מוכתם בחומר (איור 1).
על ההצלחה של פרוטוקול זה, זה הכרחי כדי: (1) להבטיח דיגום תקין של הגידול האתר/s הם lysed עבור וזמינותו, (2) לפתח טוב ממוטב ואומת אלגוריתמים של נרמול נתונים, עבור כל לוח ביטוי גנים ו/או prognostic בודדים או סמנים ביולוגיים חזוי. לשעבר תלוי ניסיון טכני של המדען/הטכנאי ביצוע הדגימה. מומלץ לקחת את ליבה נוספים ולהכין microarray של רקמות (TMA) בתבנית זהה לתבנית של וזמינותו מולטיפלקס חרוז מגנטי (96-ובכן תבנית). זה יספק ארכיון של גידול אתרים כמו העתק של דגימות המשמשות עבור וזמינותו מבוססי ה-RNA. ניסית אותו בעבר יכול להידרש גם עם טכניקות טיפול נוספות מחקר מעקב או אימות של תוצאות. פיתוח אלגוריתמים נורמליזציה תלויה החומר נחקר ואת הגנים תהליך שנבחר עבור נרמול. פאנלים שונים של נורמליזציה גנים נבחרה בהתבסס על רמת ההשתנות של ביטוי במדגם ניתח, זה משתנה בין סרטן רקמות מארצות שונות, exosomes פלזמה או מחזורי תאים סרטניים. אימות של וזמינותו כולל מדגם עיבוד מאז תכשירים שונים גם תוצאה של אלגוריתמים שונים נורמליזציה.
לסיכום, השימוש בטכנולוגיה bDNA בשילוב עם טכנולוגיה מגנטית חרוז, הבחירה של הלוח נכונה של היעד גנים, יספק יתרון נוסף של ביטוי גנים ישירות בתוך רקמת lysates נגזר כמויות קטנות של מדידה החולה חומר, כולל exosomes גשמי, microdissected, מחזורי תאים סרטניים. בנוסף זיהוי של הגידול הטרוגניות, השימוש של פאנלים יש את היכולת לזהות גידול נגזר exosomes בשלבו המוקדם, גילוי מוקדם של הישנות. מכיוון שאין צורך צעד הגברה חומצת גרעין, הגברה אות באמצעות הטכנולוגיה bDNA, בשילוב עם תירגע מבוסס-חרוז, אמצעי ביטוי גנים מרובים בחומר ארכיוני מבואר קלינית ולספק משאב עבור סמן אימות.
The authors have nothing to disclose.
העבודה נתמכה על ידי (1) השד סרטן בפרוייקט מלגה (2014-2016) ממומן על-ידי הפעולה עבור קרן סרטן השד ו 2013 חי באמצעות חדשנות ומחקר, פיתוח אמון (RIDT) של אוניברסיטת מלטה, (2) בפקולטה לרפואה & ניתוח, אוניברסיטת מלטה ופרויקטים (3) ACT הממומן על ידי המועצה מלטה למדע ולטכנולוגיה באמצעות היתוך: ה פ אני 2016 תכנית פיתוח טכנולוגיה. הפרסום של כתב יד זה נתמך באמצעות המענק יופיטר-Luminex.
Microtome | Leica | RM2235 | |
Heamatoxylin Mayer's | Sigma | MHS16-500mL | |
Eosin Y Aquaeous solution | Sigma | HT110216-500mL | |
Normal Rabbit Serum | Monosan | MONX10963 | Working dilution: 1/40 |
Biotinylated Rabbit anti-mouse | Dako | E0354 | Working dilution: 1/200 |
ER antibody (6F11) | Vector Laboratories | VPE614 | Working dilution: 1/45 |
HER2 antibody (CB11) | Novocastra | CB11-L-CE | Working dilution: 1/325 |
Ki67 antibody (MIB-1) | Dako | M7240 | Working dilution: 1/500 |
Avidin Biotin Complex kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope | Nikon | Ti-E | 4x, 10x, 20x and 40x objectives |
Laser Microdissection membranes | Molecular Machines &Industries | S0103 | |
mmi CellCamera 1.4 | Molecular Machines &Industries | MX4285c-ACK07 | |
mmi Cellcut Plus | Molecular Machines &Industries | ||
Diffuser caps | Molecular Machines &Industries | 50210 | |
mmi Celltools Software v.4.01rcl | Molecular Machines &Industries | ||
Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355000038 | |
1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670522 | |
96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670565 | |
Labnet Vortemp 56 Shaking incubator | Labnet | 52056A-220 | |
LX200 100/200 | Luminex | Magnetic bead analyser | |
Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit – FFPE Tissues | ThermoFisher Scientific | QS0109 | |
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation) | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
Thermaseal RTS Sealing Film | Thermaseal | 765246 | |
Hand-Held Magnetic Plate Washer | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit | Affymetrix/Panomics | QS0517 | |
Proteinase K (50µg/µL) | ThermoFisher Scientific | 14622 | |
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets | ThermoFisher Scientific | Various | |
Multi Speed Vortex | Kisker Biotech | MSV-3500 | |
Sonicator | Silvercrest | ||
RNASEZAP | Sigma | R2020-250ML | |
Aluminium 96-well plate seal | Sigma | Z721549-100EA | |
Temperature Validation Kit | ThermoFisher Scientific | QS0517 | |
RapidMiner Studio Community 7.1.001 | RapidMiner | Data Science Platform | |
Hybridisation oven | Hybaid (Thermo Scientific) |