अभिलेखीय ऊतक, ट्यूमर विविधता, और ताजा जमे हुए ऊतक नमूनों की कमी में न्यूक्लिक एसिड क्षरण नकारात्मक रूप से दुनिया भर में विकृति प्रयोगशालाओं में कैंसर नैदानिक सेवाओं को प्रभावित कर सकते हैं । इस पांडुलिपि के एक मल्टीप्लेक्स चुंबकीय मनका परख का उपयोग कर स्तन कैंसर को वर्गीकृत करने के लिए एक पैनल के अनुकूलन का वर्णन ।
अभिलेखीय ऊतक, ट्यूमर विविधता, और ताजा जमे हुए ऊतक नमूनों की कमी में न्यूक्लिक एसिड क्षरण नकारात्मक रूप से दुनिया भर में विकृति प्रयोगशालाओं में कैंसर नैदानिक सेवाओं को प्रभावित कर सकते हैं । जीन प्रवर्धन और अभिव्यक्ति नैदानिक संग्रह सामग्री या सामग्री है कि सेवा प्रयोगशालाओं के लिए परिवहन की आवश्यकता का उपयोग कर परीक्षण, एक और अधिक मजबूत और सटीक वर्तमान नैदानिक कार्यप्रवाह के लिए अनुकूलित परीक्षण की जरूरत है । हमारे अनुसंधान टीम Invitrogen ™ QuantiGene ™ Plex परख (थर्मामीटरों फिशर वैज्ञानिक) का उपयोग करने के लिए अभिलेखीय सामग्री में आरएनए-डीएनए (bDNA) Luminex xMAP® चुंबकीय मोतियों पर प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के लिए अनुकूलित । इस पांडुलिपि में वर्णित जीन अभिव्यक्ति परख एक उपंयास, जल्दी है, और मल्टीप्लेक्स विधि है कि सही ढंग से विभिंन आणविक उपप्रकारों में स्तन कैंसर वर्गीकृत कर सकते हैं, इमेजिंग तकनीक में निहित व्याख्या के मनोवाद लोप । इसके अलावा, आवश्यक सामग्री के कम इनपुट के कारण, विषम ट्यूमर लेजर microdissected Hematoxylin और Eosin (एच एंड ई) दाग वर्गों का उपयोग कर सकते हैं । इस विधि नैदानिक क्षमता और तरल बायोप्सी में है, जो बेहतर रोगी प्रबंधन और रोग की निगरानी की अनुमति होगी की माप के साथ ट्यूमर वर्गीकरण सहित संभव आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला है । इसके अलावा, अभिलेखीय सामग्री में अंकन के मात्रात्मक माप नैदानिक व्याख्या सामग्री के पुस्तकालयों के लिए उपयोग के साथ ऑन्कोलॉजी अनुसंधान में उपयोगी है, जिसमें पूर्वव्यापी अध्ययन संभावित मार्कर्स और उनके नैदानिक परिणाम को मान्य कर सकते हैं सहसंबंध.
आरएनए आधारित परख का अनुकूलन formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड (FFPE) सामग्री का उपयोग शल्य ऊतक प्रसंस्करण और आरएनए के क्षरण में परिवर्तनशीलता के कारण चुनौतीपूर्ण ऊतक अखंडता के संरक्षण के लिए इस्तेमाल किया formalin की वजह से है1, 2. अभिलेखीय सामग्री से सटीक जीन अभिव्यक्ति अध्ययन प्रदर्शन की सीमा को दूर करने के लिए, हमारे समूह bDNA मल्टीप्लेक्स चुंबकीय मनका परख का इस्तेमाल किया । एक लक्ष्य टेंपलेट के एंजाइमी प्रवर्धन के बजाय, bDNA प्रौद्योगिकी विशिष्ट जांच और एक रिपोर्टर संकेत3के प्रवर्धन के संकरण का उपयोग करता है । कैप्चर और डिटेक्शन जांच के छोटे पहचान अनुक्रम लक्ष्य आरएनए4के छोटे टुकड़े करने के लिए संकरण करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं । इसके अलावा, इस परख में प्रत्यक्ष शुरू सामग्री के रूप में ऊतक homogenates का उपयोग करते हैं, आरएनए के अपरिहार्य नुकसान पर काबू पाती है कि पूर्व आरएनए निष्कर्षण और शुद्धि की आवश्यकता परख से परिणाम. संकेत प्रवर्धन, कम मांयता दृश्यों का उपयोग करें, और एक शुद्धि चरण के बहिष्कार, परख के तकनीकी बदलाव में कमी करने के लिए योगदान । प्रौद्योगिकी मल्टीप्लेक्स को परख (८० आरएनए लक्ष्य तक) और कम सामग्री इनपुट से लक्ष्य के एक पैनल की अभिव्यक्ति को मापने की संभावना प्रदान करता है । इस प्रोटोकॉल की तैयारी और लेजर microdissection के लिए ऊतक के नमूनों के दाग का वर्णन । झिल्ली स्लाइड पर धुंधला ट्यूमर और ऊतकवैज्ञानिक वास्तुकला के सही चयन और रूपरेखा प्रदान करने के लिए इमेजिंग की सुविधा: (1) ट्यूमर और स्तन ऊतक में सामान्य नलिकाओं, और (2) विषम ट्यूमर के भीतर घातक सेल क्लोनों.
स्तन कैंसर के आणविक वर्गीकरण एक प्रक्रिया है कि पूछताछ आणविक मार्करों तीन आणविक वर्गों में रोगी ट्यूमर को वर्गीकृत करने के लिए, यानी, चमकदार, मानव एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 (HER2)-समृद्ध, और बेसल उपप्रकार. HER2-समृद्ध उपप्रकार अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है, HER2 रिसेप्टर की उच्च अभिव्यक्ति के साथ, ERBB2 जीन प्रवर्धन के कारण, कम या अनुपस्थित एस्ट्रोजन रिसेप्टर (एर) और प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर (पीजीआर) के साथ संयुक्त. चमकदार उपप्रकार आम तौर पर एर के लिए सकारात्मक है और बेसल उपप्रकार तीन रिसेप्टर्स (HER2, एर, पीजीआर) के लिए सामान्य नकारात्मक में हैं, और काफी ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर (TNBC) नैदानिक उपप्रकार5,6के साथ ओवरलैप. अंय मार्करों उपकला और mesenchymal विशेषताओं का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जाता है । Fibronectin (FN1) स्तन ऊतक mesenchymal डिब्बे का एक मुख्य घटक है । वृद्धि हुई FN1 अभिव्यक्ति उच्च Ki67 धुंधला के साथ है, और एक और अधिक इनवेसिव ट्यूमर के लिए एक हस्ताक्षर से पता चलता है7,8 और मेटास्टेसिस9के साथ जुड़ा हुआ है । दिलचस्प है, FN1 को ट्यूमर कोशिकाओं से उत्पंन microvesicles में उपस्थित होना पाया गया था, कि प्राप्तकर्ता fibroblasts10में mitogenic संकेतों के सक्रियण प्रेरित । इसलिए, ऐसे exosomes के रूप में परिसंचारी microvesicles जल्दी पता लगाने या मेटास्टेसिस और11पलटा के संभावित मार्कर हैं ।
स्तन कैंसर के लिए ट्यूमर क्षेत्र चयन transcriptional उपलेखन macrodissection12,13द्वारा किया गया है आवर्तक रूप । ऊतक विविधता पर काबू पाने और संवेदनशीलता में वृद्धि करने के लिए, हम मज़बूती से मल्टीप्लेक्स आणविक रूपरेखा तरीकों के साथ शास्त्रीय ऊतक दाग संयुक्त है । सिद्धांत का एक सबूत के रूप में, दो अलग स्तन कैंसर क्लोन उनके उपकला mesenchymal हस्ताक्षर और मेटास्टेटिक क्षमता द्वारा परिभाषित किया गया है । वर्णित प्रोटोकॉल के कार्यप्रवाह को आसानी से वर्तमान नैदानिक सेटअप करने के लिए अनुवाद किया जा सकता है और चुनिंदा अलग और लक्षित mRNA रूपरेखा का उपयोग ऊतक उपप्रकार की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया ।
एक मनका आधारित मल्टीप्लेक्स bDNA परख को नीचा दिखाया FFPE स्तन कैंसर के ऊतकों और सामांय स्तन नलिकाओं से व्युत्पंन आरएनए पर जीन अभिव्यक्ति मात्रा को अनुकूलित किया गया । परख अनुकूलन, शामिल एक एल्गोरिथ्म विकसित करने के लिए चमकदार और बेसल उपप्रकार में स्तन कैंसर के ट्यूमर वर्गीकृत 8 अच्छी तरह से ज्ञात मार्क्स और 5 संभावित जीन सामांय उपयोग । डेटा सामांयीकरण सामान्य जीन का परिवर्तन का उपयोग किया गया था. सामांय जीन का चयन रिसेप्टर स्थिति की सबसे अच्छी भविष्यवाणी के आधार पर किया गया था चमकदार/बेसल वर्गीकारक जीन का उपयोग कर । FFPE ऊतकों से चमकीले/बेसल उपप्रकार वर्गीकृत करने के लिए, सामान्य जीन का चयन किया गया बीटा-actin (ACTB), Glyceraldehyde 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH), और Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
विधि सामांय जीन सेट के पर्याप्त चयन के बाद अंय नैदानिक और अनुसंधान क्षेत्रों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । अनुसंधान के क्षेत्र में इस पद्धति के एक महत्वपूर्ण आवेदन है कि अच्छी तरह से नैदानिक परिणामों के साथ व्याख्या है अभिलेखीय सामग्री में है । यह पूर्वव्यापी अध्ययन में संभावित पूर्वानुमान मार्करों को मान्य कर सकता है, जल्दी और सही, और रोग मुक्त जीवन रक्षा और समग्र जीवन रक्षा डेटा का इंतजार दीर्घकालिक भावी अध्ययनों से बचें । वर्तमान में हमारे समूह परख के उपयोग की जांच कर रहा है रिसेप्टर पॉजिटिव exosomes, जो एक नए डेटा सामान्यीकरण के लिए वैकल्पिक सामान्य जीन का उपयोग कर एल्गोरिथ्म के विकास की आवश्यकता का पता लगाने के लिए. तरल बायोप्सी और मजबूत जीन अभिव्यक्ति परख का उपयोग उच्च प्रवाह मल्टीप्लेक्स परख उपचार के दौरान रोगी प्रबंधन के लिए अनुकूलित की अनुमति देगा, और एक उपचार प्रभावकारिता का पालन करें, संभावित पतन चिकित्सा के लिए प्रतिरोध के कारण प्रदान करते हैं, और ट्यूमर की मेटास्टेटिक क्षमता ।
इस विधि भी ट्यूमर के निदान में संभव आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला है और वर्तमान नैदानिक कार्यप्रवाह के लिए अनुकूलित है । नैदानिक क्षेत्र में इस विधि के मुख्य लाभ में शामिल हैं: (1) उच्च प्रवाह परख के कार्यांवयन, (2) मनोवाद और गोलमोल छवि से उत्पंन परिणामों को छोड़कर-माप आधारित है, (3) कई लक्ष्यों का सही पता लगाने इसके साथ ही, जो सटीकता बढ़ाने और कीमती मरीज के नमूनों के उपयोग को कम करने, और (4) अत्यधिक विशिष्ट सुविधाओं और मानव संसाधनों के लिए कोई आवश्यकता नहीं है । अनुकूलित नमूना प्रक्रिया, एक साथ मनका के लिए आवश्यक सामग्री के कम इनपुट के साथ-मल्टीप्लेक्स परख आधारित, ट्यूमर विविधता की आगे की जांच की अनुमति देता है; लेजर microdissection का उपयोग करके सही एक ही रोगी अनुभाग से घातक ऊतक के कई घावों को अलग करने के लिए, यह उन दोनों के बीच के रूप में अच्छी तरह से मिलान सामान्य ऊतक (चित्रा 4) के साथ के बीच कई जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए संभव है. कम सामग्री इनपुट ट्यूमर बायोप्सी पर नैदानिक आवेदन है कि सीमित ट्यूमर ऊतक प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है । अपमानित आरएनए नमूनों से जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए परख की क्षमता एक संस्था के भीतर विश्लेषण के लिए नमूनों की आसान परिवहन या प्रयोगशालाओं को चलाने की अनुमति देता है । इसके अलावा, पूरे अनुभाग विश्लेषण भी संभव एच एंड ई सना हुआ सामग्री का उपयोग कर रहा था (1 चित्रा) ।
इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए, यह करने के लिए आवश्यक है: (1) ट्यूमर साइट का उचित नमूना सुनिश्चित/एस कि परख के लिए लीजड ड है और (2) अच्छी तरह से अनुकूलित और सत्यापित डेटा सामांयीकरण एल्गोरिदम विकसित, प्रत्येक जीन अभिव्यक्ति पैनल के लिए और/ या भविष्यवाणी की है कि मार्क्स । पूर्व तकनीशियन के तकनीकी अनुभव पर निर्भर करता है और नमूना प्रदर्शन वैज्ञानिक । यह एक अतिरिक्त कोर लेने के लिए और मल्टीप्लेक्स चुंबकीय मनका परख (९६ अच्छी तरह से प्रारूप) के एक ही प्रारूप में एक ऊतक microarray (TMA) तैयार करने की सिफारिश की है । यह आरएनए-आधारित परख के लिए इस्तेमाल नमूनों की एक प्रतिकृति के रूप में ट्यूमर साइटों की एक संग्रह प्रदान करेगा । TMAs भी अनुवर्ती अनुसंधान या परिणामों के सत्यापन के लिए अंय तकनीकों के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है । सामांय एल्गोरिदम के विकास की जांच की जा रही सामग्री पर निर्भर है और सामान्य जीन सामान्य के लिए चयनित. सामान्य जीन के विभिन्न पैनलों के स्तर और नमूना विश्लेषण में अभिव्यक्ति की परिवर्तनशीलता के आधार पर चयनित कर रहे हैं और यह विभिन्न मूल से कैंसर के ऊतकों के बीच बदलता है, प्लाज्मा से exosomes, या ट्यूमर कोशिकाओं घूम. परख के सत्यापन के बाद से विभिंन तैयारी भी विभिंन सामांय एल्गोरिदम में परिणाम होगा नमूना प्रसंस्करण शामिल हैं ।
संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, चुंबकीय मनका प्रौद्योगिकी और लक्ष्य जीन के उचित पैनल के चयन के साथ संयोजन में bDNA प्रौद्योगिकी के उपयोग के लिए, सीधे ऊतक lysates की छोटी मात्रा से व्युत्पंन में जीन अभिव्यक्ति को मापने का जोड़ा लाभ प्रदान करेगा रोगी सामग्री, microdissected सामग्री सहित, exosomes, और परिचालित ट्यूमर कोशिकाओं. ट्यूमर विविधता का पता लगाने के अलावा, पैनलों के समुचित उपयोग जल्दी निदान और पलटा के जल्दी पता लगाने के लिए ट्यूमर व्युत्पंन exosomes का पता लगाने की क्षमता है । के बाद से वहां एक न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन कदम के लिए कोई ज़रूरत नहीं है, संकेत प्रवर्धन bDNA प्रौद्योगिकी का उपयोग कर, मनका आधारित मल्टीप्लेक्स के साथ संयुक्त, नैदानिक व्याख्या अभिलेखीय सामग्री में कई जीन अभिव्यक्ति के उपाय और के लिए एक संसाधन प्रदान की पुष्टि ।
The authors have nothing to disclose.
काम के द्वारा समर्थित किया गया था (1) एक स्तन कैंसर परियोजना छात्रवृत्ति (2014-2016) स्तन कैंसर फाउंडेशन और जिंदा २०१३ के लिए कार्रवाई द्वारा वित्त पोषित अनुसंधान, नवाचार और विकास ट्रस्ट (RIDT) के माध्यम से माल्टा विश्वविद्यालय के, (2) चिकित्सा के संकाय और सर्जरी, माल्टा विश्वविद्यालय और (3) परियोजना के माध्यम से विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए माल्टा परिषद द्वारा वित्तपोषित अधिनियम फ्यूजन: आर एंड आई प्रौद्योगिकी विकास कार्यक्रम २०१६ । इस पांडुलिपि के प्रकाशन को जौव-Luminex अनुदान के माध्यम से समर्थन प्राप्त है ।
Microtome | Leica | RM2235 | |
Heamatoxylin Mayer's | Sigma | MHS16-500mL | |
Eosin Y Aquaeous solution | Sigma | HT110216-500mL | |
Normal Rabbit Serum | Monosan | MONX10963 | Working dilution: 1/40 |
Biotinylated Rabbit anti-mouse | Dako | E0354 | Working dilution: 1/200 |
ER antibody (6F11) | Vector Laboratories | VPE614 | Working dilution: 1/45 |
HER2 antibody (CB11) | Novocastra | CB11-L-CE | Working dilution: 1/325 |
Ki67 antibody (MIB-1) | Dako | M7240 | Working dilution: 1/500 |
Avidin Biotin Complex kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope | Nikon | Ti-E | 4x, 10x, 20x and 40x objectives |
Laser Microdissection membranes | Molecular Machines &Industries | S0103 | |
mmi CellCamera 1.4 | Molecular Machines &Industries | MX4285c-ACK07 | |
mmi Cellcut Plus | Molecular Machines &Industries | ||
Diffuser caps | Molecular Machines &Industries | 50210 | |
mmi Celltools Software v.4.01rcl | Molecular Machines &Industries | ||
Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355000038 | |
1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670522 | |
96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670565 | |
Labnet Vortemp 56 Shaking incubator | Labnet | 52056A-220 | |
LX200 100/200 | Luminex | Magnetic bead analyser | |
Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit – FFPE Tissues | ThermoFisher Scientific | QS0109 | |
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation) | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
Thermaseal RTS Sealing Film | Thermaseal | 765246 | |
Hand-Held Magnetic Plate Washer | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit | Affymetrix/Panomics | QS0517 | |
Proteinase K (50µg/µL) | ThermoFisher Scientific | 14622 | |
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets | ThermoFisher Scientific | Various | |
Multi Speed Vortex | Kisker Biotech | MSV-3500 | |
Sonicator | Silvercrest | ||
RNASEZAP | Sigma | R2020-250ML | |
Aluminium 96-well plate seal | Sigma | Z721549-100EA | |
Temperature Validation Kit | ThermoFisher Scientific | QS0517 | |
RapidMiner Studio Community 7.1.001 | RapidMiner | Data Science Platform | |
Hybridisation oven | Hybaid (Thermo Scientific) |