Schmidtea 서 planarian 줄기 세포 및 조직 재생을 공부에 대 한 우수한 모델입니다. 이 게시는 선택적으로 한 기관, 인 두, 화학 나트륨 아 지 드를 동물을 노출 하 여 제거 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 또한 인 두 재생을 모니터링 하기 위한 방법을 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Planarians는 flatworms는 중생에서 매우 효율적인. 그들은 빚이 수 많은 부상의 모든 종류에 신속 하 게 응답할 수 있는 줄기 세포. 이 동물에 일반적인 부상 모델 조직, 여러 장기를 손상의 다량을 제거 합니다. 극복 하기 위해이 광범위 한 조직 손상, 여기 planarian Schmidtea 지중해에서 단일 기관, 인 두를 선택적으로 제거 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 시 토 크롬 산화 효소 억제제 나트륨 아 지 드를 포함 하는 솔루션에 몸을 담글 동물에 의해 이것을 달성. 나트륨 아 지 드에 짧은 노출 우리가 "화학 절단" 이라고 부르는 동물에서 인 두의 돌출을 하면 화학 절단 전체 인 두를 제거 하 고 작은 상처 인 두 소장에 연결을 생성 합니다. 광범위 한 rinsing 후 모든 절단된 동물 약 1 주일에서 완전 한 기능 인 두를 다시 생성 합니다. 줄기 세포는 시체의 나머지 부분에서 새로운 인 두의 재생 드라이브. 여기, 우리는 자세한 제공 화학 절단에 대 한 프로토콜 및 성공적인 절단 및 중생을 평가 하기 위해 조직학 및 행동 방법을 설명.
서론
재생 재생 용량 전신 재생 특정 무척 추 동물에서에서 척추1에서 더 제한 된 능력에 이르기까지 동물의 왕국에 걸쳐 발생 하는 현상입니다. 교체 기능 조직의 복잡 한 과정이 고 종종 여러 종류의 세포 동시 복원을 수반 한다. 예를 들어 도롱뇽 다리, osteoblasts, chondrocytes, 신경, 근육, 그리고 될 필요가 상피 세포를 다시 생성 하려면2를 대체 합니다. 이 새로 생성 된 셀 형식 또한 새로운 다리 기능을 촉진 하기 위하여 제대로 구성 해야 합니다. 이러한 복잡 한 프로세스를 이해 기법을 재생 특정 세포 유형 및 기관으로의 통합에 초점을 해야 합니다.
재생 반응의 연구를 단순화 하기 위해 고용 전략 중 하나입니다 대상된 제거 중 특정 종류의 세포 또는 조직의 더 큰 컬렉션. 예를 들어 zebrafish, 표현의 특정 셀에 nitroreductase 그들의 파괴 후에 metronidazole3,4의 응용 프로그램을 리드. 초파리 애벌레에서 조직의 특정 발기인에서 프로-apoptotic 유전자 표현 imaginal 디스크<....
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프로토콜
1입니다. 준비
-
Planaria 물 준비 17
- 1 X Montjuïc 소금 솔루션에서 planarians을 유지 관리 합니다. 준비 planarian 물, 개별 재고 솔루션 1 M CaCl2, 1m MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl과 초순에 5 M NaCl을 확인 합니다. 필터-0.2 µ m 병 맨 filterfor 장기 저장과 소독.
참고: (25 ° C에서 18.2 m ω의 저항)와 초순 이온을 제거 된 물만을 사용 하 여 준비 계곡이 소금. - 5 X 소금 솔루션의 1 리터 재고를 준비 하려면 1 M CaCl2, 1m MgSO4, MgCl2, KCl과 900 mL 초순에 5 M NaCl 솔루션의 1.6 mL 0.5 mL의 0.5 mL의 5 mL의 5 mL을 결합 합니다. 이 솔루션에 NaHCO3 0.504 g를 추가 하 고 섞어 저 어. 염 산 7.0에 pH를 조정 합니다.
- 두이 일 농도 대용량 유리병 등 무 균 용기에 초순에 X 1 재고 솔루션 배 희석 (
- 1 X Montjuïc 소금 솔루션에서 planarians을 유지 관리 합니다. 준비 planarian 물, 개별 재고 솔루션 1 M CaCl2, 1m MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl과 초순에 5 M NaCl을 확인 합니다. 필터-0.2 µ m 병 맨 filterfor 장기 저장과 소독.
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결과
나트륨 아 지 드에 노출 동물 스트레칭 하 고 몸부림을 일으키는 planarians의 정상적인 운동 성 방해. 이러한 움직임은 동물의 복 부 측에서 등장 하는 인 두 고 나트륨 아 지 드 솔루션에서 약 6 분, 후 인 두의 흰색 팁을 볼 수 있다 (그림 1B-왼쪽된 패널). 몇 분 후, 동물 적극적으로 계약 하 고 완전히 몸 밖으로 강제로 그것을 추진 하 여 인 두를 확장. (그림 1B-중간 패널). 약 아 지 드 노출 후 11 분, 동물 및 인 두 긴장. 이 단계에서 인 두의 특성 종 형태는 명확 하 게 보이는 (그림 1B-오른쪽 패널). 쉽게 절단에 대 한 긴장을 인 두에 대 한 기다려야 중요 하다.
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토론
이 프로토콜 나트륨 아 지 드를 사용 하 여 인 두의 선택적 절제 하는 방법을 설명 합니다. Planarians에 다른 대상된 제거 연구 대뇌21 또는 약리 치료 dopaminergic 신경22ablate을 제거 하려면 수정된 수술을 사용 했습니다. 기존 방법에 비해 화학 절단의 중요 한 장점 중 하나입니다 그것은 수술을 요구 하지 않습니다. Planarian 시체의 나머지 부분에 비해 인 두의 경직 된 구조는 훨씬 부드러운 바디는 동물에서의 완전 한 제거를 촉진 한다. 또한, 인 두 인 두과 소장, 생성 하는 큰 수술 도구에 의해 유도 된 하나 보다 더 재현 상처 작은 접합 (식도)30 동물에서 분리 합니다. 그것의 물리적 특성 및 동물의 나머지 부분에 작은 해 부 연계를 바탕으로, 인 두 제거 따라서 다른 수술 사지 보다 더 균질 상처 생성 합니다.
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리는 감사 알 산체스 알 바로, 초기 최적화 및이 기술 개발을 지원 하 고 싶습니다. 캐롤 린 애 들러의 실험실에 일 코넬 대학 시작 기금에 의해 지원 됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 염화칼슘 이수화물 (CaCl2) | 피셔 케미컬 | C79-3 | Montjuï c 염 용액 |
| : 황산 마그네슘, 무수 (MgSO 4< / sub>) | Fisher Chemical | M65-3 | Montju ï c 염 용액 |
| 염화 마그네슘 육수 화물 (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuï c 염 용액 |
| 염화칼륨 (KCl) | Acros Organics / VWR | 196770010 | Montju ï c 염 용액 |
| 염화나트륨 (NaCl) | Acros Organics / VWR | 207790050 | Montju ï c 염 용액 |
| 중탄산 나트륨 (NaHCO3) | Acros Organics / VWR | 123360010 | Montju ï c 소금 용액 |
| Nalgene 오토클레이브 가능 폴리 프로필렌 공중 합체 lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific / VWR | 2324-0015 | 플라나리아 물 |
| 저장 인스턴트 오션 바다 소금 | 스펙트럼 브랜드 | 아마존 | 플라나리아 물 |
| 겐타마이신 황산염 | 쌍둥이 자리 바이오 제품 | 400-100P | 플라나리아 물 |
| 면도날 | 전자 현미경 과학 | 71970 | 다진 간 |
| 일회용 페이스트리 백-16", 12 | Wilton | Amazon | 간 부분 표본 |
| 5mL 주사기 | BD/VWR | 309647 | 간 부분 표본 |
| 페트리 접시-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| 플라스틱 용기(다양한 크기) | Ziploc | Amazon | Housing 정적 배양의 플라나리아 |
| 지드 | 나트륨 시그마 | S2002 | |
| 트랜스퍼 피펫 | 글로브 사이언티픽 | 138030 | |
| 펜치 - Dumont 핀셋, 스타일 5 | 전자 현미경 과학 | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 접합체 | , ThermoFisher | S11223 | |
| 글리세롤 | Fisher BioReagents | BP229-1 |
참고문헌
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M.
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재인쇄 및 허가
