Denne artikkelen beskriver detaljert protokoller økosystem fabrikasjon enheter (EcoFABs) som aktiverer studier av planter og plante-mikrobe interaksjoner i kontrollerte laboratorieforhold.
Fordelaktig plante-mikrobe interaksjoner tilbyr en bærekraftig biologisk løsning med potensial til å øke lav-input mat og bioenergi produksjonen. En bedre mekanistisk forståelse av disse komplekse anlegg-mikrobe interaksjoner vil være avgjørende å forbedre planteproduksjon så vel som utfører grunnleggende økologiske studier undersøker plante-jord-mikrobe interaksjoner. Her er en detaljert beskrivelse av økosystemet fabrikasjon presentert, bruker allment tilgjengelig 3D Trykkemetoder, for å lage kontrollert laboratorium habitater (EcoFABs) for mekanistisk studier av plante-mikrobe interaksjoner i spesifikke miljø forhold. To størrelser av EcoFABs er beskrevet som er egnet for etterforskningen av mikrobielle interaksjon med forskjellige plantearter, inkludert Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonog Panicum virgatum. Enhetene gjennomflytsenhet tillater kontrollert manipulasjon og prøvetaking av roten microbiomes, rot kjemi samt imaging rot morfologi og mikrobiell lokalisering. Denne protokollen inneholder detaljene for opprettholde sterile forhold innenfor EcoFABs og montering uavhengig LED lys systemer til EcoFABs. Detaljert metoder for tillegg av ulike medier, inkludert jord, sand, og flytende vekst medier koblet til karakterisering av disse systemene med imaging og metabolomics er beskrevet. Sammen disse systemene aktiverer dynamisk og detaljert undersøkelse av anlegg og plante-mikrobiell konsortier inkludert manipulering av microbiome komposisjon (inkludert mutanter), overvåking av plantevekst, rot morfologi, sårvæske komposisjon, og mikrobiell lokalisering under kontrollerte forhold. Vi forventer at disse detaljert protokollene vil tjene som et viktig utgangspunkt for andre forskere, ideelt å skape standardisert eksperimentelle systemer for å undersøke plante-mikrobe interaksjoner.
Anvendelsen av fordelaktig plante mikrober i landbruket tilbyr stort potensial til å øke bærekraftig mat og biodrivstoffproduksjon å sørge for en voksende befolkning1,2,3,4. En betydelig mengde arbeid støtter betydningen av anlegget microbiomes i anlegget nærings-opptak, toleranse for påkjenninger og motstand mot sykdom5,6,7,8. Det er imidlertid vanskelig å undersøke disse mekanismene av plante-mikrobe interaksjoner i feltet økosystemer kompleksitet og tilknyttede irreproducibility og manglende evne til å kontrollere nøyaktig microbiome sammensetning og genetikk (f.eks., bruke mikrobiell mutanter)4,9,10.
En strategi er å konstruere forenklet modell økosystemer aktivere kontrollert, repliserte laboratorieforsøk undersøker plante-mikrobe samhandlinger for å generere innsikt som kan bli ytterligere testet i feltet10,11, 12. Dette konseptet bygger på tradisjonelle tilnærminger bruker planter dyrket i jord-fylt Potter eller agar plater i veksthus eller inkubatorer13. Selv om dette vil trolig være mest brukte tilnærminger, de mangler nøyaktig overvåke og manipulere anlegget vekst miljøer. Disse endene, rhizoboxes og rhizotrons representerer en stor forbedring i evnen til å studere under-bakken prosesser14,15, og første protokollene ble utgitt for å analysere rhizosphere metabolitter i jord16. Flere nylig, for å aktivere høy gjennomstrømning analyse, avansert microfluidic enheter13,17 som plante Chip18,19, RootArray20og RootChip21, har vært utviklet som effektive verktøy for anlegget phenotyping med mikrometer skala romlig oppløsning til å overvåke de tidlige vekst stadiene av lite anlegget Arabidopsis thaliana i flytende flyt medium. Nylig ble en to-lags tenkelig plattform beskrevet som gjør at roten håret avbildning av Arabidopsis thaliana på frøplante scenen med en microfluidic plattform22.
Her, er detaljert protokoller for å konstruere kontrollert laboratorium enheter (EcoFABs) angitt, for å studere anlegget mikrobe interaksjoner og viser at de kan brukes til å studere ulike planter inkludert Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon23, økologisk viktige wild havre Avena barbata, og bioenergi beskjære Panicum virgatum (switchgrass). EcoFAB er en steril anlegget vekst plattform som inkluderer to primære komponenter: EcoFAB enheten og sterile anlegget størrelse gjennomsiktig containeren. EcoFAB enhet er laget av en polydimethylsiloxane (PDMS) produksjonsprosess som involverer støping PDMS lag fra 3D trykt plast mold og liming PDMS lag på objektglass bruke metoder tidligere rapportert24,25 . Detaljerte prosedyrer for EcoFAB arbeidsflyten, for eksempel enheten fabrikasjon, sterilisering, frø spiring, frøplante transplantasjon, mikrobe inoculation/cocultivation, prøve forberedelse og analyse, er beskrevet i denne protokollen (figur 1). Ytterligere modifiseringer av grunnleggende arbeidsflyten er beskrevet, inkludert installasjon av datamaskin kontrollert LED vokse lysene og utnyttelse av solid underlag. Utnyttelsen av imaging teknikker for å undersøke rot morfologi endres, mikrobielle kolonisering av røtter, og masse spektroskopiske avbilding av root eksudater beskrives. Vi forventer at enkle, rimelige design basert på tilgjengelige materialer, samt detaljert protokollene som presenteres her, vil bli EcoFAB plattformen til et fellesskap ressurs, standardisering plante-microbiome laboratoriestudier.
Protokollene rapporteres her for å bruke økosystem fabrikasjon opprette EcoFABs inneholder ressurser for systematisk anlegget biologi studier i kontrollerte laboratorieforhold. Fremskritt i 3D-utskrift gir allment tilgjengelige teknologier for bygging og iteratively raffinering EcoFAB design. Roten kammeret presenteres her er funnet for å være godt egnet for imaging mikroskopi og vedlikeholde sterilitet, aktivere kontrollert tilførsel av mikrober å undersøke plante-mikrobe interaksjoner. Den EcoFAB plattformen er kompatibel med forskjellige plantearter. Det er viktig å erkjenne fysiologiske effekter av dyrking av planter i smale roten kammeret slik at flere eksperimenter vil måtte generalisere funn til planter vokser i naturskjønne omgivelser.
Bruk av steril kamre og vokse lampe kan undersøke effekten av ulike lysforhold, inkludert bølgelengde, intensitet og varighet på plantevekst og relaterte fysiologiske parametere parallelt. Reversibel bonding rot kammer tillate bruk av fast underlag også som romlig samle faste stoffer for biokjemiske og genetiske analyser. Programmene av solid underlag, som jord, sand og kvarts perler, tilbyr mulighetene for å bruke EcoFABs til å lage mer økologisk relevante laboratorium økosystemer. Men forbedre alle systemene presenteres her bruk mettet væske (hydroponic kulturer) som ikke er en nøyaktig refleksjon av de fleste jord, og det vil være viktig å ytterligere designene å opprettholde luftlommer i jorda slik at de bedre representerer naturlig jord.
Bruk av både enkle kameraer og mikroskoper beskrives bilde rotsystem morfologi utvikling på begge bulk til mobilnettet nivå. Denne egnethet for overvåking rot morfologi bildebehandling og kvantifisering vil trolig være nyttig for å forstå de regulatoriske mekanismene av anlegget fysiologiske og molekylære signaler utløst av anlegget genotypic tilpasninger vekst forhold. En begrensning for å studere fysiologiske root utvikling er imidlertid gjeldende vannrette plassering av EcoFAB enheten. I naturskjønne omgivelser fører røtter gravitropic svaret til en overveiende vertikal utvikling med rotsystem. Dermed vannrett systemet presenteres her sannsynlig forskjellig i noen faktorer fra et naturlig miljø, og fabrikasjon av EcoFAB systemer med loddrett plassering av roten kammeret er ønskelig mål for fremtidige EcoFAB versjoner. Selv om gjeldende EcoFAB enhetene plasseres horisontalt, er analyse av rot morfologi parametere i ulike forhold, eller som svar på mikrober, mulig. Høyoppløselige bilder kan brukes for å fange rot kolonisering dynamikken i enkelt isolerer eller samfunn, gir informasjon om hvilke anlegg deler er kolonisert i ulike næringsstoffer tilstrekkelig og mangelfulle forhold. Det er forventet at slike studier vil gi viktig ny innsikt i hvordan plante microbiomes er samlet, og hvordan disse dynamikk endres over tid, for eksempel som røttene utvikle.
Microfluidic enheter aktiverer imaging svært unge planter, og vanligvis mengden metabolitter samlet er ikke tilstrekkelig for LCMS analyse. Jord-basert systemer, for eksempel rhizotrons, tillate avbilding av rot morfologi når enten Plantene er forvandlet chemiluminescent konstruksjon (Glo-rot) eller NMR-baserte metoder33,34. Metabolitten utdrag fra disse systemene er tidkrevende store volum av prøver. EcoFABs er en kombinasjon av begge: fabrikasjon ligner microfluidic enheter. EcoFABs var ment å være enkelt og billig å reprodusere, men størrelsen på kammeret kan justeres for å vokse planter med små eller store rotsystem, til sine reproduktive stadier. Samtidige observasjoner av rot morfologi endringer og rot exudation er mulig. Systemet er sterilt, aktivere kontrollert tilførsel av bestemte mikrober.
EcoFABs utformet for å muliggjøre kontrollert introduksjon og utvalg av mikrober og metabolitter. Spesielt er prøver fra roten vekst kammer funnet for å være tilstrekkelig for masse spektroskopiske metabolitten profilering. Integrering av massespektrometri imaging (f.eks., NIMS teknikk presenteres her) gir en ikke-destruktiv tilnærming med å studere metabolitten romlige distribusjoner med rotsystem. Denne teknikken vil trolig være nyttig i fremtiden stabil isotop sporing eksperimenter og kartlegging mikrobiell lokalisering bestemt metabolitter36. Mens denne protokollen har fokusert på enkelt isolerer, kan samme design sikkert brukes for mer komplekse samfunn. Eksempel volumer og biomasse innen EcoFABs sannsynligvis mer enn nok for videre integrasjon med DNA sekvensering teknologi, som vil være viktig å karakterisere og overvåking mikrobielle samfunn struktur og gene expression.
Avslutningsvis denne protokollen detaljer fabrikasjon av laboratoriet økosystemer designet for etterforskningen av plante-mikrobe interaksjoner, med vekt på enkle og tilgjengelige metoder som lett kan gjennomføres og forlenget med forskere rundt den verden. Dagens innsats er rettet mot demonstrere reproduserbarhet mellom laboratorier og integrering av en temperatur control system slik at hver EcoFAB vil ha uavhengig kontrollert lys og temperatur. En ytterligere fremgang av systemet vil være integreringen av automatiserte utvalg og påfylling av EcoFAB rot kammer og utvikling av reproduserbar protokoller for å etablere relevante anlegget microbiomes innenfor EcoFABs.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Laboratory regissert forskning og utvikling (LDRD) program av Lawrence Berkeley National Laboratory støttes av Office of Science, av US Department of Energy under Kontraktnr. DE-AC02-05CH11231 og en pris DE-SC0014079 fra den amerikanske avdelingen av energi Office of Science til UC Berkeley. Arbeid på molekylære støperiet ble støttet under US Department av energi Kontraktnr. DE-AC02-05CH11231. Vi takker også Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen og Benjamin J. Cole ved Lawrence Berkeley National Laboratory for all deres hjelp.
3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
Ethanol | VWR | 89125-172 | |
Bleach | |||
Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |