Ett protokoll för matrix-assisted laser desorption jonisering tiden för flygningen masspektrometri (MALDI-TOF MS) karakterisering av syntetiska polymerer beskrivs bland annat optimering av provberedning, spektrala förvärv och dataanalys.
Det finns många metoder som kan användas i karakterisering av syntetiska homopolymerer, men få ger lika användbar information för slutet Gruppanalys som matris-assisted laser desorption jonisering tid av flygning masspektrometri (MALDI-TOF MS). Denna handledning visar metoder för optimering av provberedningen, spektrala förvärv, och dataanalys av syntetiska polymerer med MALDI-TOF MS. kritiska parametrar under provberedning inkluderar val av matrisen, identifiering av en lämplig cationization salt och trimma de relativa proportionerna av den matris, ering och analyt. Förvärv parametrarna, till exempel läge (linjär eller reflektor), polarisering (positiv eller negativ), acceleration spänning och fördröjningstiden, är också viktiga. Med tanke på vissa kunskaper i kemi inblandade att syntetisera polymeren och optimera parametrarna data förvärv såväl prov förberedelse villkoren, bör spectra uppnås med tillräcklig upplösning och massa noggrannhet för att aktivera den entydiga bestämning av slutet grupperna av de flesta homopolymerer (samlas under 10 000) förutom upprepa enheten massa och övergripande molekylvikt distribution. Men visat på en begränsad uppsättning polymerer, är dessa allmänna tekniker tillämpliga på ett mycket bredare utbud av syntetiska polymerer för att bestämma massutskick, men slutet gruppen bestämning är endast möjligt för homopolymerer med smala systemdispertionen.
Med förbättringar i levande polymerisation tekniker, precision polymerer med kvantitativt functionalized slutet grupper är alltmer tillgängliga1. Den samtidiga utvecklingen av natriumazid-alkynen och thiolene Klicka kemier har aktiverat nästan kvantitativa kopplingen av makromolekyler till andra beståndsdelarna, som ger tillgång till ett utbud av hybrid material2,3,4 . Dock krävs exakta analystekniker för att karakterisera både start material och produkter av dessa polymer konjugation reaktioner. Matrix-assisted laser desorption/jonisering tid för flygning masspektrometri (MALDI-TOF MS) är en värdefull mjuk jonisering analytisk teknik för att karaktärisera polymerer eftersom det kan generera polymer joner i en enda laddning med minimal fragmentering5,6. MALDI-TOF MS har stora fördelar över andra konventionella metoder för polymer karakterisering eftersom den kan ge masspektra med upplösning av den enskilda n-mers inom polymer massdistribution. Som en följd kan sådan masspektra tillhandahålla exakt information om den genomsnittliga molekylvikten, upprepa massenhet, och molekylvikt systemdispertionen7, som i sin tur kan belysa konkurrerande polymerisation mekanismer såsom kedja överföring8 . MALDI-TOF MS är dock särskilt kraftfulla att ge information om polymer slutet grupper9,10, som kan användas för att bekräfta slutet grupp ändringar10,11 och andra transformationer12 såsom polymer cyclizations11,13. Lika viktigt, den relativt lilla mängden analyt (sub-mikrogram) krävs för massa spektrometriska analys gör denna teknik användbar för karakterisering när bara spår kvantiteter av material är tillgängliga.
MALDI-TOF MS analys av polymerer kan delas in i fyra olika steg: prov förberedelse, instrumentkalibrering, spektrala förvärv och dataanalys. Provberedning är det viktigaste steget för att skapa optimerade MALDI-TOF masspektra och sker innan provet introduceras till instrumentet14,15. Valet av en lämplig matris med liknande löslighet parametrar till polymer analyten är avgörande för att få hög kvalitet MALDI-TOF masspektra och riktlinjer för matrix urval har rapporterat någon annanstans14,15, 16,17. En databas av polymer MALDI ”recept” för provberedning har också varit publicerad online18. För romanen polymerer, kan matrix urval kontaktas genom första förstå lösligheten hos polymeren och välja en matris med liknande löslighet parametrar14,19. Polymerer med hög proton affinitet kan vara protonerade av de flesta matriser14 (som ofta innehåller karboxylsyra grupper), men för andra polymerer, är en cationization agent krävs14. Alkali joner addukt väl med syrehaltiga arter (t.ex. polyester och Polyetrar), medan omättade kolväten (t.ex. polystyren) addukt med övergången metaller såsom silver och koppar joner14, 19. eftersom de polymer proverna i detta experiment innehöll syreatomer i ryggraden, natrium eller kalium trifluoroacetate (TFA) användes som cationization agenten. När matrix och cationization agenter har valts, måste de relativa proportionerna av analyten, katjon agent och matrix optimeras noggrant för att säkerställa hög signal till brus. I den här proceduren, parametrar för provberedning har redan optimerats, men en empiriska exempel optimering procedur (steg 1.4.1., figur 1) som systematiskt varierar halterna av de tre komponenterna (analyten, Matrix och katjon) är effektivt för att snabbt fastställa deras optimala förhållanden.
Dataförvärv kräver också optimering av ett antal parametrar. De viktigaste parametrarna är positiv eller negativ jon funktionsläget av spektrometern, instrumentet funktionsläge (linjär kontra reflektor), acceleration spänningen och utvinning fördröjningstiden. Ett annat sätt att resolutionen kan ökas är genom utnyttjande av ”reflectron” läge20,21,22,23. Reflectron läge i huvudsak fördubblar flygbanan av joner till detektorn genom reflekterande jonerna i slutet av flygningen röret tillbaka mot en detektor nära källan medan fokusering joner med olika framfarter och därför öka upplösningen men minskar signalstyrkan. Dessutom kan högre upplösning spectra erhållas genom att minska den lasereffekt vilket minimerar signal-brus-förhållandet genom att minska antalet och energi av kollisioner och därför minska fragmenteringen och kinetiska inhomogeneities24. Genom att trimma alla dessa parametrar, kan jonerna inriktas för att minimera effekten av eventuella inhomogenitet i utgångsläget eller hastighet som uppstår under processen laser desorption. När förvärvet parametrarna optimeras, uppnås ofta isotopiska upplösning för joner med massorna som överstiger 10 000 Da, men detta är också beroende av längden på flyg röret och instrument design. De flesta organiska föreningar som innehåller minst en heteroatomen är benägna att komplexbildande med alkali katjoner såsom litium, natrium och kalium. Många av alkalimetaller är monoisotopes eller begränsad isotoper och därför inte bredda distributionen.
Medan parametrarna som instrument kan stämmas för att optimera data precision, uppnås datanoggrannhet endast med en lämplig kalibrering11. Proteiner och peptider användes ursprungligen som calibrants på grund av deras monodispersity och tillgänglighet, men lider av variabel stabilitet och förekomsten av föroreningar25. Mer kostnadseffektiv och stabil alternativ har inkluderat oorganiska kluster och polydisperse polymerer26,27,28,29. Tyvärr, dessa alternativ funktion skingra massorna, som komplicerar massa uppdrag, liksom mindre massorna sammantaget gör dem användbara endast för kalibreringar under 10.000 Da. Att bekämpa dessa problem, Grayson et al. 25 utvecklat en dendrimer-baserad, polyester MS kalibreringssystem som är monodisperse, och ståtar med både breda matris och lösningsmedel kompatibilitet, hållbarhet stabilitet (> 8 år) och lägre produktionskostnad. Baserat på styrkan i detta system, valdes det som standard för dessa experiment.
Det finns två huvudtyper av kalibrering: inre och yttre30. När kalibrera externt, placeras en standard med massor som hållare av Analytens på MALDI mål plattan i en olika provposition än analyten att generera separat masspektrum som en kalibrering fil kan genereras. Däremot, kan ökad precision ofta uppnås med en intern kalibrering, som innebär att blanda standard med analyten att erhålla en hybrid spektrum med både standard och analyt signaler. I proceduren som beskrivs nedan, genomfördes en extern kalibrering. Efter ordentlig kalibrering av massa skalan, kan korrekt Analytens massa data förvärvas. För att säkerställa den mest korrekt kalibreringen, är det viktigt att dataförvärvet inträffar strax efter kalibreringen.
Slutligen, när den optimerade, kalibrerad datauppsättningar förvärvades och data analyserades för att tillhandahålla strukturella om polymerprover. Avståndet mellan n-mers inom polymer fördelningen kan ge exakt mätning av upprepande enheten massa. De antal genomsnittlig molekylvikt (Mn) och andra mass distribution beräkningar (t.ex., Mw (vikt medelmolekylvikt) och Đ (systemdispertionen)) kan också bestämmas från signal distribution i den masspektra ( steg 4,2 för beräkningar). Kanske mest unikt, kan när det gäller homopolymerer, summan av slutet gruppen massorna bekräftas genom att bestämma förskjutningen av polymer fördelning med avseende på massan av upprepande enheterna ensam. De informationsrika MALDI-TOF masspektra tillhandahålla värdefulla karakterisering data som är komplement till mer traditionella polymer karakterisering tekniker såsom storlek utslagning kromatografi, Fourier-transform infraröd spektroskopi, och kärnmagnetisk resonans.
MALDI-TOF masspektrometri är en ovärderlig analytiska verktyg för polymer karakterisering på grund av dess förmåga att generera polymer joner i tillståndet ensamma laddade och med minimal fragmentering. Denna mjuka jonisering teknik använder tredjeparts korta laserpulser för att desorb solid-state prover av polymer analyten inbäddad i en matris som förening för att generera polymer joner i gasfas. Makromolekyler är vanligtvis joniserat genom komplexbildning med katjoner som läggs till matrix att aktivera deras analys av masspektrometri. Dessa makromolekylära joner accelereras sedan av en extraktion spänning att bringa dem i regionen fält-fri flygning röret som kan aktivera sina m/z skall bestämmas utifrån deras time-of-flight mellan ion källan och detektor5 , 32.
Jämfört med andra tekniker för karakterisering av polymer, är MALDI-TOF MS spectra kvalitet starkt beroende av data förvärv parametrar och provberedning. Även om det finns ingen set formel för provberedning, möjliggör förstå funktionen av varje komponent i provberedningen snabbare empiriska optimering. Den viktigaste faktorn i MALDI provberedning är urval av matrisen eftersom kompatibilitet matris med polymer analyten är kritisk för att låta upphetsad matris att generera enda, desorberat makromolekyler i en joniserad staten5, 15,17,19. När lämplig matris och cationization agenter har valts, måste det rätta förhållandet av analyten, matris och cationization agent bestämmas. Detta kan uppnås empiriskt genom att skapa ett tvådimensionellt rutnät av prover (figur 1) på MALDI-TOF MS mål plattan (figur 2) med ökande matrix koncentration på en axel och ökande cationization agent koncentration på den andra.
Liknar MALDI provberedning, det finns ingen set formel för att bestämma data förvärv parametrar; vissa trender bör dock anses påskynda spektrala optimering. Reflectron läge, vilket förbättrar upplösningen men minskar övergripande signal, väljs vanligen för lägre massa spänner (i de här exemplen nedan 4 000 Da) där isotopiska upplösning kan uppnås. I dessa fall användes monoisotopic massa beräkningar och peak Plockningsmetoder. För polymerprover med massorna över 4000 Da användes linjärt läge med genomsnittlig massa beräkningar och topp plocka metoder. För att förbättra signal upplösning, ion källa spänningar bör justeras i små steg med den allmänna trenden av större massa polymerer har en större spänning differential (IS1 kontra IS2).
Tag optimerad provberedning och förvärvet parametrar kan ge precision, massa noggrannhet kan endast uppnås genom effektivt kalibrering. Den time-of-flight för en given massa kan variera subtilt med avseende på variabeln förvärv parametrar och även plattan positioner, därför en kalibrering utföras för varje uppsättning optimerad förvärv parametrar för att ge korrekta mass bestämningar5,30. När förvärvet parametrar och provberedning har optimerats, bör spektra kalibreras med dessa exakt samma villkor.
På grund av enastående upplösning och massa noggrannhet observerades i de optimerade MALDI-TOF masspektra av polymerer, har denna teknik blivit en värdefull gratis verktyg för att bestämma polymer massdistribution data. Men dess förmåga att lösa enskilda upprepade enheter inom polymer massdistribution ger en viss fördel för slutet Gruppanalys i förhållande till andra polymer karakterisering tekniker såsom gel permeation chromatography (GPC) och kärnkraft kärnmagnetisk resonans (NMR). Detta är särskilt värdefullt för att fastställa trohet i slutet gruppen funktionalisering reaktioner och slutet gruppen konjugationer reaktioner kvantitativ karaktär. Detta manuskript har visat förmåga att lösa massa individuella polymer upprepade enheter med upp till två decimaler pekar av massa noggrannhet, aktivera bekräftelse av slutet grupp ändringar med en hög nivå av förtroende. Med de betydande framsteg som har gjorts nyligen inom precision polymersyntes, MALDI-TOF MS blir ett allt viktigare verktyg för bestämma makromolekylära struktur och funktionalitet.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner Smart materialdesign, analys och bearbetning konsortiet (SMATDAP) finansieras av National Science Foundation under samarbetsavtal IIA-1430280 och LA styrelse Regents för en graduate fellowship (MEP). Polymerprover för dessa experiment tillhandahölls av MilliporeSigma (Sigma-Aldrich). Öppna Access publikation i denna artikel är sponsrad av MilliporeSigma.
polyoxyethylene bis(azide) (Mn=2000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 689696 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en®ion=US |
poly(ethylene glycol) 2-amino-ethyl ether acetic acid (Mn= 5000) | MilliporeSigma (Aldrich) | 757918 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en®ion=US |
poly(L-lactide), thiol terminated (Mn=2500) | MilliporeSigma (Aldrich) | 747386 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide low | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS20 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide medium | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS21 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en®ion=US |
SpheriCal® peptide high | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | PFS22 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en®ion=US |
2,4 dinitrofluorobenzene | TCI | A5512 | |
maleimide | MilliporeSigma (Aldrich) | 129585 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en®ion=US |
1-ethynylfluorobenzene | Fisher Scientific | 766-98-3 | |
triethylamine | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 471283 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en®ion=US |
N,N,N',N",N"-pentamethyldiethylenetriamine | MilliporeSigma (Aldrich) | 369497 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en®ion=US |
Copper(I)Bromide | MilliporeSigma (Aldrich) | 254185 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en®ion=US |
glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38212 | |
sodium metabisulfite | MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | 13459 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en®ion=US |
potassium trifluoroacetate | MilliporeSigma (Aldrich) | 281883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en®ion=US |
trans-2-[3-(tert-butylphenyl)-2-methyl-2-properylidene]malononitrile | MilliporeSigma (Aldrich) | 727881 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en®ion=US |
a-cyano-4-hydroxycinnamic acid | MilliporeSigma (Sigma) | C8982 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en®ion=US |
tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T425-1 | |
dichloromethane | VWR Analytical | BDH1113-4LG |