상호 작용 및 찰 흙 및 영역 내에서 해양, 자연적인 환경에서 관찰 된 세균성 세포의 침전 제어 환경에서 최고의 조사 수 있습니다. 여기, 우리는 점토와 cyanobacterial floccules의 침전 속도 측정 하기 위한 새로운 방법을 설명 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
메커니즘의 세분화 된 증 착을 underpinning, 유기 부유한 앙금은 여전히 크게 논의. 특히, 퇴적암 레코드에 반응, planktonic cyanobacterial 셀과 점토 입자의 상호 작용의 영향 아래 공부 했습니다. 이 상호 작용은 셰 일 depositional 모델에 잠재적으로 큰 기여. 랩 설정 내에서 이러한 물질의 응집 및 침전 속도 검사 고 제어 된 환경에서 측정 될 수 있습니다. 여기, 우리 선발 cyanobacterial/점토 혼합물의 침전 속도 측정 하기 위한 프로토콜. 이 방법론은 두 개의 샘플 실험의 설명을 통해 증명: 고령 토 (kaolinite의 탈수 형태) 및 Synechococcus sp. PCC 7002 (해양 coccoid 박테리아)를 사용 하는 첫 번째 및 두 번째 고령 토 및 를 사용 하 여 Synechocystis sp. PCC 6803 (민물 coccoid 박테리아). Cyanobacterial 문화는 다양 한 양의 연속, 실시간 비디오 및 사진 기록 수 있도록 최적화 된 특별히 고안 된 탱크 장치 내에서 점토와 혼합 됩니다. 샘플링 절차 후 컬렉션 프로토콜의 엽록소는 는 cyanobacterial 세포 현 탁 액에 남아의 농도 결정 될 수 있는 정확한 측정을 위한 뿐만 아니라 자세히 나와 있습니다. 실험적인 복제를 통해 프로필 침전 속도 표시 하는 구성 되어 있습니다.
서론
과거의 depositional 메커니즘 유추를 존재 하는 환경 조건 및 프로세스를 사용 하 여 오랫동안 sedimentology underpinning입니다. 검은 바다 같은 현대 depositional 아날로그 유기 풍부한, 세분화 된 예금의 증 착을 이해 하는 것 사용 되었다, 실험실 실험 혈 암 예금의 근원에 추가 해 주실 수가 있다. 검은 혈 암의 창세기에의 한 지역 증 착 속도 및 원래 형성의 메커니즘 이다. 전통적으로, 그것은 되었습니다 가설 검정 shales 침전 속도, 기본 생산성 및 유기 물 호흡 속도 앙금1,2 유기 물질의 보존을 촉진 하는 환경에서 형성 ,3. 그러나, cyanobacterial의 역할 클레이 응집 크게 경솔하게 남아 있다. 응집이이 메커니즘 발생, 유기 풍부한, 세분화 된 앙금의 빠른 증 착에 대 한 허용 및 낮은 산소를 필요로 하지 않는다. 고려이 전제,이 프로토콜은 두 가지 목표: 1) cyanobacterial/클레이 floccules의 침전 속도 측정 하 고 2) 실시간으로 침전 과정을 시각화. 지구 화학 분석 외에이 방법론은 그 cyanobacterial/클레이 응집 사실 셰 일 형성1에 대 한 중요 한 메커니즘 수 있습니다 보여 주기 위해 사용 되었습니다. 원래 셰 일 증 착 모델링을 위한, 하는 동안이 메서드는 생물학, 환경 치료 등 다른 분야에 적용 가능한 세균성 물질 대사 및 인구에 클레이 입력의 영향 측정 될 필요가.
박테리아 및 유해 조류 꽃2,3,,45,6,7 을 완화 하기 위해 점토의 응집을 관찰 수많은 연구를 실시 했습니다. , 8 , 9 , 10 , 11 , 1 그러나 2., 시간이 지남에 따라 세포 농도 측정 하는 동안 이러한 연구에 적용 되지 않은 박테리아/클레이 응집 바위 기록의 증 착 모델링. 따라서, 이러한 연구는 과거의 sedimentological 프로세스 모델링 때 중요 한 될 수 있는 시각적 구성 요소를 부족 합니다. 또한, 연구의 대다수 셀 계산 활용 (예를 들어, 팬 외. 11), 힘 드는 수 있습니다. 측정 cyanobacterial 응집, 최근의 진보와 함께 우리의 방법 측정 하 여 엽록소는 a (Chl a) 이산 시간 간격 cyanobacterial 셀 농도에 변화를 결정 합니다. Chl 시각적 데이터 측정을 페어링 depositional 조건을 유추할 수 사용 될 수 있는 새로운 접근 방식입니다. 생성 된 이미지 또한 뒤 외에서 작업 후 침전 속도 계산에 사용할 수 있습니다. 13. 결과의 신뢰성을 강화 하는 시각 및 숫자 데이터의 조합. 또한, 우리는 관찰도 죽은 바이오 매스와 점토의 침에 대 한 허용 하는 추가적인 프로토콜 개요. 어디 라이브 sedimentological 환경, 과거 고려 때 이것은 중요 하 고 죽은 바이오 매스 공동 발생 할 수 있습니다. 응집 동안 죽은 바이오 매스의 행동에 차이 (예를 들어 응집 속도 감소) sedimentological 의미 있을 것 이다.
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프로토콜
1. 준비 Cyanobacterial 문화
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단단한 미디어를 사용 하 여 접종 문화 준비
- 미국 유형 문화 수집 또는 파스퇴르 문화 컬렉션에서 axenic cyanobacterial 셀을 가져옵니다. 예를 들어 단 세포, 해양 Synechococcus 특검팀 PCC 7002 파스퇴르 문화 컬렉션에서 얻은, 그것은 금 후 Synechococcus으로 참조 됩니다.
- 단단한 미디어 (+ 액체14 와 1.5% agar15)를 포함 하는 접시에 Synechococcus 세포를 유지 합니다. 이 금 후에 접종 문화로 참조 됩니다.
- 30-50 µmol 광자 m-2 s-1,15,18에서 제공 하는 지속적인 빛 32 ± 2 ° C에 접시를 품 어.
- 1.1-1.3 단계를 반복 하 고 + 미디어 단계 1.1.2 민물 cyanobacterial 종,17, Synechocystis 의 sp PCC 6803.16,에서 BG 1116 으로 여기서 언급 바꿉니다 Synechocystis. A + 및 BG-11 미디어의 구성 표 1-4 를 참조 하십시오.
-
액체 문화 준비: 각 탱크 실험 요구 한 400 mL cyanobacterial 문화.
- 한 250 mL 및 두 1 L 내 열 삼각 플라스 크를 수집 합니다.
- 4m 염 산 (HCl) 솔루션 각 플라스 크에 대 한 HCl 솔루션의 (30 mL), 증류수 다음 각 플라스 크를 헹 구 십시오.
주의: 염 산 이며 부식성 독성입니다. 실험실 외 투, 안전 고글, 및 부식 방지 장갑 4 M HCl 솔루션을 사용 하는 동안 착용 하는 확인 하십시오. 실험실 싱크대에이 단계를 수행 하 고 4 M HCl 해결책의 처리에 관한 현지 규정에 따라 - (A + 또는 BG-11) 액체 매체의 50 mL로 250 mL 플라스 크를 채우십시오. (A + 또는 BG-11) 액체 매체의 400 mL와 함께 한 1 L 플라스 크와 미디어 (A + 또는 BG-11)의 600 mL와 다른 1 L 플라스 크를 입력 합니다.
- 가스 투과성 거품 스 토퍼와 함께 각 플라스 크를 밀봉 하 고 은박지를 거품 마 개 및 플라스 크 목 커버.
- 레이블 및 고압 121 ° C와 25 분에 대 한 100 kPa에 플라스 크를 실내 온도에 냉각 플라스 크 허용.
- 70% 알코올로 표면 살 균 하 여 층 류 후드를 준비 합니다.
- 와이어 접종 루프, 분 젠 버너, (1.2.5 단계)에서 냉각된 50 mL 액체 플라스 크와 접종 문화 (에서 단계 1.1)를 수집 합니다. 멸 균된 흐름 후드에 이러한 항목을 놓습니다.
- 짧게 분 젠 버너의 불꽃을 사용 하 여 와이어 접종 루프를 소독 하 고 진정 있습니다.
- 접종 문화 수집 cyanobacterial 셀의 표면에 따라서 쿨 루프를 끕니다.
- (폼 마 개 감동) 없이 250 mL 플라스 크에서 거품 스 토퍼와 호 일 모자를 제거 하 고 불꽃을 통해 간략하게 전달 하 여 삼각 플라스 크의 가장자리를 소독.
- 미디어 플라스 크의 목 근처 이므로 플라스 크를 기울기 고 플라스 크로 셀과 코팅 접종 루프를 삽입 합니다. 루프는 미디어에 빠져들은, 일단 세포 제거를 접종 루프를 저 어.
- 접종 루프를 제거 하 고 다시 분 젠 버너 불꽃을 사용 하 여 플라스 크의 입술을 소독.
- (폼 마 개 감동) 없이 거품 스 토퍼 및 삼각 플라스 크에 호 일 모자를 교체 합니다.
- 분 젠 버너 화 염 내에서 간단히 접종 루프를 소독.
- 준비 (성장 챔버 라고도 함) 성장 방 온도 30 ° C15,18 에 유지와 빛의 강도 30-50 µmol 광자 m-2 s-1,15,18 . 습도 적극적으로 제어 하지.
- 30 ° c.의 유지 온도와 성장 챔버에 150 rpm에서 떨고에 의해 품 어 접종된 50 mL 문화 허용 계속 증발 손실을 제어 하 고 오염을 방지 하기 위해 교 반 동안 덮여 플라스 크의 입.
- 96 h에 대 한 성장 cyanobacterial 문화를 허용 한다. 성공적인 문화 한다 밝은 녹색 표시 그리고 광학 밀도 (OD)에서 750 nm 0.4-0.6의.
- 문화는 충분히 성장 했다, 일단 50 mL 문화와 층 류 두건에서 (1.2.5 단계)에서 액체 미디어의 400 mL를 포함 하는 1 L 플라스 크를 놓습니다. 흐름 후드 소독된 다음 단계 1.2.6 확인 하십시오.
- 층 류 흐름 후드 내에서 두 플라스 크에 대 한 단계 1.2.10를 반복 합니다.
- 1 L 플라스 크에 미디어의 400 mL 50 mL 문화 부 어 하 고 다시 분 젠 버너 불꽃을 사용 하 여 1 L 플라스 크의 입술을 소독.
- 거품 스 토퍼 및 호 일 모자 대신 폼 마 개, 피 펫, 플라스틱 튜브, 인라인 필터 구성 된 살 균 버블링 장치를 부착 하 고 플라스 크의 입에 덮개를 호 일.
- 300 mL/min에서 솔루션15,18 통해 습도 공기 혼합물을 회람 하는 공기 펌프에 연결 된 bubbler 기구와 30 ° C에서 150 rpm에서 1 L 플라스 크를 교 반 하십시오.
- 120-168 h 30 ° C에서 성장 챔버 내 성장 문화를 허용 한다. 성공적인 문화 밝은 녹색을 표시 해야한다 고는 OD750 nm 0.4-0.6의.
- 점토와 혼합 되지 것입니다 제어 문화를 생산 하는 1.2 단계를 반복 합니다.
- 죽은 바이오 매스를 사용 하 여 실험 한 추가 단계가 필요 합니다. 오토 클레이 브 1 L 플라스 크 121 ° C에서 60 분에 대 한 문화 고 실내 온도에 냉각.
2. 실험 설정
- 형광등 (9 T8 전구, 적어도 2600 루멘;의 은행 앞 (길이 20 cm의), 30 cm의 5.1 c m의 너비와 높이 직사각형 아크릴 탱크 배치 그림 1) 19.
- 빛의 뱅크와 탱크를 통해 빛나는 빛을 확산 하기 위해 탱크 반투명, 흰색 플라스틱 시트를 놓습니다. 이 설정 서덜랜드 외. 에서 적응 시켰다 19
- 마크 10 센티미터의 높이에 아크릴 탱크 기지에서 수직으로 측정. 모든 샘플링의 일관성을 보장 물 열이이 높이에서 모든 측정 할 수 있습니다.
- 각 실험 기록 탱크 앞 1m, 삼각대에 카메라를 배치 합니다. 비디오 카메라와 이미지, 비디오 파일에서 추출 될 수 수학적 모델링 소프트웨어를 사용 하 여 비디오 파일 안정화 역학19를 모델링 하는 데 사용할 수 있습니다 것이 좋습니다.
- 검은 천으로 빛 은행, 탱크, 그리고 카메라 외부 광원 (그림 1)에서 실험을 방패를 놓습니다.
3. 응집 실험 프로토콜
- 400 mL 문화 (1.2 단계), 큰 등급된 실린더, 및 600 mL 1 L 플라스 크 (1.2.5 단계)에 추가 성장 매체의 수집.
- 졸업된 실린더를 사용 하 여 1 L의 최종 볼륨을 추가 성장 미디어 (A + 또는 BG-11) 400ml 문화 (4-6 mg/mL의 초기 세포 농도)을 희석. 아크릴 탱크에이 솔루션을 추가 합니다.
- 라벨 및 아크릴 탱크 근처 편리한 위치에 배치 하 여 2 mL microfuge 관을 준비 합니다. 실험에 대 한 클레이의 50 g을 측정 합니다.
- 비디오 녹화를 시작 합니다. 여러 실험의 경우 실험 식별자 기호 수 일시적으로 전에 개최 카메라.
- 피 펫을 사용 하 여 1 mL 샘플 고 레이블이 microfuge 관에. 이 샘플을 사용 하 여 초기 cyanobacterial 세포 수는 OD를 측정 하 여 결정750 nm 값. 정확한 결과 보장 하기 위해 3 중에서 모든 샘플을 가져가 라.
- 신속 하 게 부 어 클레이 (50 g) 탱크에 교 반 막대기를 사용 하 여 10-15에 대 한 활발 한 동요와 함께.
- 타이머를 시작 하 고 Chl P1000 피 펫 (샘플 시간0)를 사용 하 여 결정에 대 한 초기 1 mL 샘플을 가져가 라.
- 적절 한 시간 간격 (예:1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 10 분, 15 분, 30 분, 60 분, 180 분, 240 분) 추가 샘플을 가져가 라.
- 실험 완료 되 면 비디오 파일을 저장 하 고 비디오 카메라를 해제 한 Chl 결정 (4 단계) 에 대 한 모든 샘플을 처리.
- 압력솥 나머지 점토/cyanobacterial 솔루션입니다. Cyanobacterial 종, 법규, 및 연구소 정책에 따라 적절 한 방법을 사용 하 여 솔루션의 처분. 깨끗 한 비누와 물, 탱크 증류수로 그것을 씻어 하 고 공기 건조.
- 추가 없는 점토와 제어 실험을 준비 합니다. 같은 시간 지점에서 샘플을 가져가 라. 이 데이터는 점토, 아니라 자연 정착의 결과와 응집으로 인해 안정화 속도 향상 된 것인지 다른 실험 데이터를 비교할 수 있습니다.
- 실험 기간 동안 죽은 바이오 매스를 사용 하는 경우 동일한 실험적인 절차를 사용 합니다. 그러나, 솔루션의 처리 절차는 압력가 마로 소독을 필요 하지 않습니다.
4. 샘플 처리 및 평가
- Chl Owttrim16에서 수정 하는 절차를 사용 하 여 각 셀 샘플의 농도 결정 합니다. 일단 수집, 13000 x g 는 microcentrifuge를 사용 하 여 실내 온도에 3 분 동안 각 샘플에서 셀을 펠 렛.
- P1000 피 펫을 사용 하 여 초과 미디어를 제거 하 고 100% 메탄올 (20 ° C)의 1 mL를 추가 합니다. 소용돌이 1 분 셀 펠 릿 resuspend 최고 속도로 샘플.
주의: 메탄올은 유독 하 고 가연성. 장갑, 안전 안경, 착용 하 고 점화 소스에서 메탄올을 유지. - Chl는 는의 적 출을 촉진 하기 위하여 24 시간 동안-20 ° C에서 샘플을 품 어.
- 부 화, 후 4.1에 설명 된 대로 세포 파편을 펠 릿, 녹색 표면에 뜨는 베트는 피 펫을 사용 하 여 전송 고는 베트는 분 광 광도 계 합니다. 1 분 샘플 내 모든 나머지 점토 침전 하 고 측정을 방해 하지 않습니다에 대 한 분 광 광도 계에 샘플을 수 있습니다.
- 665에서 흡 광도 측정 하 여 농도 Chl를 spectrophotometrically 결정 및 652 nm, 및 750에서 OD nm. Chl는 농도는 수식 Chl는 는 사용 하 여 결정 됩니다 (는665 -OD750)-x 16.29 = (는652 -OD750) x 8.54 20. Chl 농도 세포 농도 대 한 프록시로 사용 됩니다. 또한, 1010 셀/L x 7.4의 변환 계수 = 10 g/L21 일부 cyanobacterial 종족의 그램에서 셀 농도 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다.
- 플롯은 Chl 시간에 대 한 값을 계산합니다.
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결과
점토에 드러낼 때, cyanobacterial 세포 현 탁 액22에서 주어진 다. 이 대표적인 결과 여기에 설명 했다. Cyanobacterial 인구에 점토의 효과 확인 하 고 관찰 하는 침전 속도, 두 실험 기간 동안 Synechococcus 및 Synechocystis 50 g/L 고령 토 찰 흙 (표 5-6, 에 노출 됐다 실시 했다 그림 2-3). 1 단계에서 설명한 대로 cyanobacterial 문화 성장 했다. 그 후, 탱크 (2 단계)를 설정한 후 희석된 Synechococcus 문화 탱크에 부 어 되었고 50 g 3 단계에 따라 고령 토 찰 흙의 혼합. 이것은 Synechocystis 문화에 대 한 반복 되었다. 모든 샘플은 탱크에서 ...
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토론
응집 cyanobacterial 셀-클레이 상호 작용에 의해 촉매 생태 및 엔지니어링2,3,,45,6,7 분야에 관심을 많이 받고 있다 그러나 ,,89,10,11,12,, 퇴적암의 증 착 모델링의 목적으로 이러한 상호 작용의 조사 예금 (혈 암) 등은 상대적으로 새로운입...
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자는 기꺼이 자연과학 및 공학 연구 위원회 캐나다의 (05448, 165831 213411)에서 자금을 인정 합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시아노박테리아 (본 연구에서: Synechococcus sp. PCC 7002 및 Synechocystis sp. PCC 6803) | 파스퇴르 배양 컬렉션 | PCC 7002 또는 PCC 6803 | 플레이트를 접종하는 데 사용 |
| Thermo Scientific | CM0003 | 은 두 개의 페트리 접시를 채우는 데 사용됩니다 | |
| 트리 플레이트(표준 세균학, 100 x 15 mm) | Sarstedt | 82.1473.001 | 2 필요 |
| 1 L 내열성 삼각 플라스크 | Pyrex | 4980-125 | 1 필요 |
| 250 mL 내열 삼각 플라스크 | Pyrex | 4980-250 | 1 필요 |
| 니크롬 접종 루프 | 손잡이 Fisher Scientific | 14-956-103 | 1 필요 |
| 은박지 | 레이놀즈 랩 알루미늄 호일 | 89079-067 | 50cm 필요; 삼각 플라스크의 폼 스토퍼와 목을 덮는 데 사용 |
| 성장 매체(예: A+) | 1050 mL 필요; 표 1-4에 기술된 조성물을 사용하여 생산 | ||
| 분젠 버너 | Fisher Scientific | S95941 | 1 |
| 플라스틱 튜빙 | Fisher Scientific | S504591 | 1 m 필요; 버블링 장치 |
| 스폰지 스토퍼 | Jaece Industries Inc | 14-127-40E | 1 필요; 피펫을 위해 중앙에 만든 구멍; 버블링 장치 아크릴 시트를 구성하는 데 사용됩니다 |
| Home Depot | Optix 투명 아크릴 시트 모델 # MC-102S | 1 필요; 아크릴 탱크 (20 x 30 x 5.1 cm) | |
| 투명 방수 실리콘 접착제 | Home Depot | Loctite 투명 실리콘 모델 # 908570 | 1 필요; 아크릴 탱크 (20 x 30 x 5.1 cm)를 구성하는 데 사용됩니다 |
| 카메라 또는 비디오 레코더 | Panasonic | HC-V770 HD 캠코더 | 1 필요 |
| 삼각대 | Magnus | VT-300 | 1 |
| 필수 검은색 천 | PrimoMart | EAN 0726670162199; 부품 번호 680254blacknappedfr | 1 필요; duvetyne light 차단 천; 대략 152 x 213 cm로 탱크 실험을 커버할 수 있습니다 |
| 내열성 혈청학 피펫 | corning incorporated C708510 | 13-671-101G | 1 필요; 버블링 장치 샘플 바이알을 만드는 데 사용됩니다 |
| Dynalon | S30467 | 최소 12 (선택한 시간 간격에 따라 다름) | |
| 내열 유리 피펫 | Fisher Scientific | Corning Incorporated C708510, 13-671-101G | 1 필요; 버블링 장치를 만드는 데 사용됩니다. 폴리스티렌 혈청학 피펫도 작동하지만 장치의 나머지 부분을 고압증기멸균한 후 튜브와 스토퍼에 연결해야 합니다. |
| 마이크로 원심분리기 | Eppendorf | 22 62 120-3 | 1 필요; 13,000 x g 와류 기계에서 1.5 -2 mL 마이크로분리 튜브를 원심분리할 수 있는 경우 유사한 제품을 사용할 수 있습니다 |
| (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries, Inc | SI-0236 | 1 1 100 |
| % 메탄올 | Fisher Scientific | A412-500 SDS | 최소 12mL(샘플당 1mL) 필요; 주의: 가연성, 독성. 장갑과 보안경을 착용하십시오. 발화원 근처에서 사용하거나 보관하지 마십시오. 대체 소스를 사용할 수 있습니다. |
| 큐벳 (1.6 mL, 폴리스티렌) | Sarstedt | 67.742 | 최소 12 분 |
| 광 광도계 | 필요 Fisher Scientific | 222-271600 | 1 필요; Pharmacia Biotech Novaspec ll도 사용할 수 있습니다. |
| 전구 | Home Depot | 모델 # 451807; 인터넷 #205477895; 상점 SKU # 1001061538 | 빛을 제공하는 데 필요한 6-8 개의 전구 |
| (Pipetman Classic P1000 | Gilson | F123602 | 샘플 수집에 사용 |
| 37 % 염산 | Sigma-Aldrich | 258148 | 주의: 부식성 및 독성이 있습니다. 사용하는 동안 실험실 가운, 보안경 및 내산성 장갑을 착용하십시오. 화학 흄후드에서 탈이온수로 희석하여 사용하기 전에 4N으로 준비합니다. |
| 폼 스토퍼 (소) | Canlab | T 1385 | |
| 폼 스토퍼 (대) | Canlab | T 1387 | 온전한 스토퍼가 필요하고 중앙을 관통하는 단일 구멍이 있는 스토퍼 |
| 30 ° C 인큐베이터/연속 조명이 | 1 필요 | ||
| 70 % 에탄올 | Fisher Scientific | BP8201500 | 30 mL 필요; 주의: 독성 및 인화성. 실험실 가운과 보안경을 착용 |
| 소수성 공기 필터 (Midisart 2000, 0.2 µ m) | Sartorius | 17805 | 1 |
| 필수 점토(예: 카올린) | Fisher Scientific | MFCD00062311 | 최소 50g 필요 |
| 의 마이크로퓨지 튜브(2mL, 폴리프로필렌) | Sarstedt | 72.695.500 | 유사한 제품을 사용할 수 있습니다. 최소 12 (선택한 시간 간격에 따라 다름) |
| 1000 µ L 피펫 팁 | Sarstedt | 70.762 | 1 필요 |
참고문헌
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