זיהוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה
Summary
אנו מתארים פרוטוקול גילוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה איגוד של הקולטן מיון, sortilin, כדי luminal הלולאה הראשונה של החלבון טרנספורטר גלוקוז, GLUT4, כדוגמא.
Abstract
היכולת שלנו לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון הוא המפתח להבנת חיבורים רגולטוריות בתא. עם זאת, זיהוי של אינטראקציות חלבון-חלבון במקרים רבים מזוהה עם אתגרים משמעותיים ניסיוני. בפרט, קולטנים המיון אינטראקציה עם שלהם מטען החלבון בלומן של ממברנות התאים לעיתים קרובות באופן רגיש דטרגנט, ביצוע co-immunoprecipitation של חלבונים אלה לבלתי שמיש. עקדת sortilin קולטן המיון כדי נשא גלוקוז ש-glut4 עשוי לשמש דוגמה חלש luminal אינטראקציות בין חלבונים ממברנה. כאן, אנו מתארים assay מהירה, פשוטה וזולה כדי לאמת את האינטראקציה בין sortilin לבין GLUT4. בשביל זה יש תוכנן ואנו מסונתז כימית פפטיד מתויג myc התואם epitope sortilin מחייב פוטנציאליים בחלק luminal של GLUT4. מתויג עם שש histidines Sortilin הייתה הביע בתאים בתרבית של, מבודד lysates תא באמצעות קובלט חרוזים. Sortilin ותשמרו על החרוזים, נדגרה עם הפתרון פפטיד-ערכי pH שונים, החומר eluted נותחה על ידי סופג המערבי. Assay זו ניתן להתאים בקלות ללמוד אינטראקציות רגיש אבקת חלבון אחרים.
Introduction
GLUT4 הוא חלבון נשא גלוקוז הבאה לידי ביטוי בעיקר תאי שריר השלד ונטייה איפה זה שמתווכת ההשפעה של אינסולין על דם מים אחרונים גלוקוז סיווג1. להיות חלבון יציב מאוד, GLUT4 מוסדר ברמה post-translational. בהעדר אינסולין, GLUT4 הוא נשלל במידה רבה של קרום פלזמה (ומכאן נמוכה חדירות הבזליים של גלוקוז), הוא מקומי בעיקר בתוך התא שלפוחית קטנה מגיב לאינסולין (IRVs) ורשת הטרנס-גולג’י (TGN) סביר לייצג תא תורם אירב. על ניהול אינסולין, IRVs הפתיל עם קרום פלזמה ולספק GLUT4 לאתר של תפקודו. פעולה זו מגדילה את החדירות של קרום פלזמה על גלוקוז, אז את ספיגת הגלוקוז מהדם לתוך adipocytes של תאי שריר השלד עולה 10 כדי 40-fold. לאחר נסיגת אינסולין, GLUT4 הפנימו לתוך endosomes/מיון מוקדם, ואז שאוחזרו כדי TGN איפה IRVs מחדש נוצרו. מיון שני השלבים מסלול GLUT4 קרי לאחזור בלבד endosomes מוקדמת היקפיים כדי perinuclear TGN, היווצרות IRVs על התורם TGN ממברנות מופעלות על ידי בן משפחה Vps10p, sortilin, אשר מייצג את סוג אני חלבון טראנסממברנלי, קולטן המיון. על פי מודל אחד, sortilin עובד כמו חלבון transmembrane לגרדום: זה נקשר GLUT4 ב לומן של endosomes, TGN, ומגייסת מתאמים retromer או clathrin cytoplasmic לצד התורם ממברנה ויה שלה קרבוקסילי2, 3. זה מקל על ההתפלגות של GLUT4 לתוך לחברות התעופה vesicular translocate GLUT4 בין תאים תאיים.
האינטראקציה של זנב cytoplasmic של sortilin עם retromer, חלבונים שונים מתאם תועד היטב. עם זאת, הכריכה של sortilin GLUT4 (וכדי מספר שלה ליגנדים חלבונים אחרים) מאתגרת כדי להוכיח. בפרט, ניסיונות co-immunoprecipitate sortilin של GLUT4 לא היו מוצלחות כנראה בגלל מהות האינטראקציה בין שני חלבונים אלה הרגישים דטרגנט. בנוסף, כמו חלבון טיפוסי טרנספורטר, GLUT4 יש תחומים transmembrane 12 לולאות luminal 6 כל שילוב של אשר ייצגו שעשויות להיות אתר איגוד sortilin. במקביל, גוף גדול של ראיות נסיבתיות, כגון לוקליזציה שותף משמעותי בתא, cross-linking עם DSP קרום חדיר, האינטראקציה במערכת היברידית שני שמרים להציע את sortilin יכולים לאגד GLUT4. יתר על כן, באמצעות גישה האחרון בשילוב עם אלנין סריקה מוטגנזה מכוונת, אנחנו קודם לכן קבעו כי תחום Vps10p של sortilin נקשר בעיקר הלולאה luminal הראשון של GLUT4. עם זאת, ההוכחה של אינטראקציה כזו בתאים בתרבית של נעדר. כאן, יש בודדנו שלו מתויג sortilin מ transfected 3T3-L1 בתאים באמצעות שרף קובלט והפגינו זה יכול לקיים אינטראקציה עם פפטיד מסונתז כימית המתאים לתמונה luminal הראשון של GLUT4 ב- pH 6 ו- pH 8 הדומות לרקע חומצי, endosomal לומן, סביבה נייטרלית לומן של הממברנות TGN. אין איגוד פפטיד התגלה בניסויים שליטה בו תמצית מקריסטלים של תאים שאינם transfected הוטען על החרוזים באותו.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sortilin הוא קולטן אבולוציונית שנשמרת ליגנד רב חלבון שמעורב הן איתות על קרום פלזמה, תאיים מיון אירועים6,7. עם זאת, החיפוש אחר ליגנדים של sortilin אותנטי (שחלקם הם חלבוני ממברנה luminal או אינטגרלי) הוא מסובך כפי האינטראקציה של sortilin עם חלק משותפיה הכריכה מופיע יהיה רגיש ד?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר DK52057 ו- DK107498 של NIH על K.V.K. X.P נתמכה על ידי 2T32DK007201 גרנט הדרכה מוסדית של NIH.
Materials
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8849 | for use in purification of histidine tag protein |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Insulin Syringe U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23228 | |
| Wash buffer | Boston BioProducts | BP-234 | For His-tag protein purification |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine sample Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | with SDS, bMercaptaethanol should be added |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | For seperation of peptide and small protein |
| Tris/Tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Buffer | Boston BioProducts | BP-190 | Add 20% methanol |
| Nitrocellulose membrane 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antibody | Cell Signaling | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | customize ordering | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
References
- Bogan, J. S. Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes. Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).
- Kandror, K. V., Pilch, P. F. The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers. Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).
- Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes. Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).
- Kim, J., Kandror, K. V. The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4. Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).
- Shi, J., Kandror, K. V. Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes. Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).
- Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway. Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).
- Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors – regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
- Mazella, J., et al. The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor. J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).
- Ni, X., Morales, C. R. The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor. Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).
- Westergaard, U. B., et al. Functional organization of the sortilin Vps10p domain. J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).
- Nykjaer, A., et al. Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death. Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).
