झिल्ली प्रोटीन के बीच डिटर्जेंट-संवेदनशील बातचीत का पता लगाने
Summary
हम झिल्ली प्रोटीन के बीच डिटर्जेंट-संवेदनशील बातचीत का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन छंटाई रिसेप्टर, sortilin, ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर प्रोटीन, GLUT4, एक उदाहरण के रूप में की पहली चमकदार पाश के लिए बाइंडिंग का उपयोग कर ।
Abstract
प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने की हमारी क्षमता सेल में विनियामक कनेक्शन को समझने की कुंजी है । हालांकि, कई मामलों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाना महत्वपूर्ण प्रायोगिक चुनौतियों से जुड़ा होता है. विशेष रूप से, छंटाई रिसेप्टर्स झिल्ली डिब्बों के लुमेन में अक्सर एक डिटर्जेंट-संवेदनशील फैशन में उनके प्रोटीन कार्गो के साथ बातचीत, इन प्रोटीन के सह immunoprecipitation बना अनुपयोगी । ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर GLUT4 के लिए छंटाई रिसेप्टर sortilin के बंधन झिल्ली प्रोटीन के बीच कमजोर चमकदार बातचीत का एक उदाहरण के रूप में सेवा कर सकते हैं । यहां, हम एक तेज, सरल, और सस्ती परख का वर्णन करने के लिए sortilin और GLUT4 के बीच बातचीत मांय । उसके लिए, हम डिजाइन और रासायनिक संश्लेषित किया है myc-टैग sortilin के चमकीले हिस्से में क्षमता बाध्यकारी epitope के अनुरूप पेप्टाइड GLUT4 । Sortilin छह histidines के साथ टैग स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था, और कोबाल्ट मोतियों का उपयोग कर सेल lysates से पृथक । मोतियों पर Sortilin मैटीरियल अलग पीएच मूल्यों पर पेप्टाइड समाधान के साथ मशीन था, और eluted सामग्री पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गया था । यह परख आसानी से अंय डिटर्जेंट के प्रति संवेदनशील प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
GLUT4 एक ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर प्रोटीन है जो मुख्य रूप से वसा और कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, जहां यह पोस्ट-prandial रक्त ग्लूकोज की निकासी पर इंसुलिन का प्रभाव मध्यस्थता1. एक बहुत ही स्थिर प्रोटीन होने के नाते, GLUT4 एक के बाद अनुवाद स्तर पर विनियमित है । इंसुलिन के अभाव में, GLUT4 काफी हद तक प्लाज्मा झिल्ली से बाहर रखा गया है (इसलिए ग्लूकोज के लिए कम बेसल पारगम्यता) और मुख्य रूप से छोटे इंसुलिन उत्तरदायी बुलबुले में सेल के अंदर स्थानीयकृत (IRVs) और ट्रांस-Golgi नेटवर्क (TGN) है कि प्रतिनिधित्व करने की संभावना है IRV दाता डिब्बे । इंसुलिन प्रशासन पर, IRVs प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूज और अपने कामकाज की साइट के लिए GLUT4 उद्धार । यह ग्लूकोज के लिए प्लाज्मा झिल्ली की पारगम्यता बढ़ जाती है, इतना है कि adipocytes और कंकाल myocytes में रक्त से ग्लूकोज आगे बढ़ जाता है 10 करने के लिए 40 गुना. इंसुलिन वापसी के बाद, GLUT4 जल्दी में आंतरिक है/छंटाई endosomes और फिर TGN जहां IRVs फिर से बना रहे है के लिए प्राप्त की । दोनों GLUT4 मार्ग में कदम छँटाई, अर्थात् परिधीय जल्दी endosomes से perinuclear TGN के लिए है़, और IRVs दाता झिल्ली पर TGN के गठन Vps10p परिवार के सदस्य, sortilin द्वारा सक्षम हैं, जो एक प्रकार का प्रतिनिधित्व करता है i transmembrane प्रोटीन और एक छंटाई रिसेप्टर । एक मॉडल के अनुसार, sortilin एक transmembrane पाड़ प्रोटीन के रूप में काम करता है: यह endosomes और TGN के लुमेन में GLUT4 बांधता है, और अपनी सी के माध्यम से दाता झिल्ली के retromer पक्ष को clathrin या cytoplasmic एडेप्टर भर्ती-टर्मिनस2, 3. यह vesicular वाहकों में GLUT4 के वितरण की सुविधा है कि translocate GLUT4 के बीच intracellular डिब्बों ।
retromer और विभिंन एडेप्टर प्रोटीन के साथ sortilin के cytoplasmic पूंछ की बातचीत अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है । हालांकि, GLUT4 करने के लिए sortilin के बंधन (और इसके अंय प्रोटीन लाइगैंडों के कई) को साबित करने के लिए चुनौती दी गई है । विशेष रूप से, सह के लिए प्रयास immunoprecipitate sortilin और GLUT4 सफल नहीं किया गया है शायद इन दो प्रोटीन के बीच बातचीत के डिटर्जेंट के प्रति संवेदनशील प्रकृति के कारण । इसके अलावा, एक ठेठ ट्रांसपोर्टर प्रोटीन के रूप में, GLUT4 12 transmembrane डोमेन और 6 चमकदार छोरों जो के संभावित रूप से एक sortilin-बाध्यकारी साइट का प्रतिनिधित्व कर सकते है किसी भी संयोजन है । एक ही समय में, अप्रत्यक्ष सबूत के एक बड़े शरीर, जैसे कोशिका में पर्याप्त सह स्थानीयकरण, झिल्ली के साथ पार-पारगंय डीएसपी, और खमीर में बातचीत दो संकर प्रणाली सुझाव है कि sortilin GLUT4 के लिए बाध्य कर सकते हैं । इसके अलावा, alanine स्कैनिंग mutagenesis के साथ एक संयोजन में उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम पहले से निर्धारित किया है कि sortilin के Vps10p डोमेन मुख्य रूप से GLUT4 के पहले चमकदार पाश को बांधता है । हालांकि, स्तनधारी कोशिकाओं में इस तरह के एक बातचीत के सबूत याद आ रही है । यहां, हम अपने-transfected 3T3-L1 कोबाल्ट राल का उपयोग कर कोशिकाओं से sortilin टैग अलग है और प्रदर्शन किया है कि यह रासायनिक संश्लेषित पेप्टाइड पीएच 6 और पीएच 8 में GLUT4 के पहले चमकदार पाश करने के लिए इसी के साथ बातचीत कर सकते है कि अंलीय वातावरण में समान TGN झिल्ली के लुमेन में endosomal लुमेन और तटस्थ वातावरण । नियंत्रण प्रयोगों में कोई पेप्टाइड बाइंडिंग का पता लगाया गया था जहां गैर-transfected कक्षों से तैयार निकालने एक ही मोतियों पर लोड किया गया था ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Sortilin एक विकासवादी बहु ligand प्रोटीन रिसेप्टर है कि दोनों प्लाज्मा झिल्ली में संकेतन और intracellular छंटाई की घटनाओं में शामिल है6,7है । हालांकि, प्रामाणिक है sortilin लाइगैंडों के लिए खोज (जिनमें स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य के लिए अनुसंधान अनुदान DK52057 और DK107498 से NIH से K.V.K. एक्स. पी द्वारा समर्थित 2T32DK007201 से संस्थागत प्रशिक्षण अनुदान NIH का समर्थन किया गया.
Materials
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8849 | for use in purification of histidine tag protein |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Insulin Syringe U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23228 | |
| Wash buffer | Boston BioProducts | BP-234 | For His-tag protein purification |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine sample Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | with SDS, bMercaptaethanol should be added |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | For seperation of peptide and small protein |
| Tris/Tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Buffer | Boston BioProducts | BP-190 | Add 20% methanol |
| Nitrocellulose membrane 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antibody | Cell Signaling | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | customize ordering | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
References
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