Rilevamento di detersivo sensibili interazioni tra proteine di membrana
Summary
Descriviamo un protocollo per il rilevamento di detersivo sensibili interazioni tra proteine di membrana utilizzando l’associazione del ricevitore dell’ordinamento, sortilina, per il primo ciclo di luminal della proteina del trasportatore del glucosio, GLUT4, ad esempio.
Abstract
La nostra capacità di esplorare le interazioni proteina-proteina è la chiave per comprendere collegamenti normativi nella cella. Tuttavia, rilevamento delle interazioni proteina-proteina in molti casi è associata con sfide sperimentali significative. In particolare, smistamento recettori interagiscono con il loro carico di proteine nel lume dei compartimenti di membrana spesso in maniera sensibile detergente, rendendo inutilizzabile la co-immunoprecipitazione di queste proteine. Associazione dell’ordinamento sortilina recettore al trasportatore di glucosio che GLUT4 può servire come un esempio di Luminale deboli interazioni tra proteine di membrana. Qui, descriviamo un test veloce, semplice e poco costoso per convalidare l’interazione tra sortilina e GLUT4. Per questo, abbiamo progettato e sintetizzato chimicamente il peptide myc-tagged corrispondente per l’epitopo sortilina-associazione potenziale nella parte luminale di GLUT4. Sortilina taggato con sei istidine è stato espresso in cellule di mammifero e isolato da lisati cellulari usando le perle di cobalto. Sortilina immobilizzata sulle perle è stato incubato con la soluzione del peptide a valori di pH diversi, e il materiale è stato analizzato mediante Western blotting. Questo test può essere facilmente adattato per studiare altre interazioni proteine sensibili al detersivo.
Introduction
GLUT4 è una proteina del trasportatore del glucosio che si esprime principalmente in cellule di grasso e muscolo scheletrico dove media l’effetto dell’insulina, il glucosio post-prandiale sangue liquidazione1. Essendo una proteina molto stabile, GLUT4 è regolamentata a livello post-traduzionale. In assenza di insulina, GLUT4 è in gran parte esclusi dalla membrana plasmatica (quindi bassa permeabilità basale per glucosio) ed è localizzata principalmente all’interno della cellula in piccole vescicole insulina-sensible a reagire (IRVs) e trans-Golgi network (TGN) che rischia di rappresentare il vano di donatore IRV. Somministrazione di insulina, il IRVs si fondono con la membrana plasmatica e consegnare GLUT4 al sito del suo funzionamento. Questo aumenta la permeabilità della membrana del plasma per il glucosio, in modo che l’assorbimento di glucosio dal sangue in adipociti e miociti scheletrici aumenta 10 a 40 volte. Dopo il ritiro di insulina, GLUT4 è interiorizzato in endosomi precoce/ordinamento e quindi estratto a TGN dove il IRVs sono ri-formata. Sia l’ordinamento passi nel pathway di GLUT4, cioè recupero dall’endosomi precoce periferici ad perinucleare TGN e la formazione del IRVs sul donatore TGN membrane sono abilitate per il membro della famiglia Vps10p, sortilina, che rappresenta un tipo la proteina del transmembrane e un recettore ordinamento. Secondo un modello, sortilina funziona come una proteina transmembrana impalcatura: si lega GLUT4 in lumen del endosomi e TGN e reclute retromer o clatrina adattatori al lato citoplasmico del donatore membrana tramite suo C-terminus2, 3. questo facilita la distribuzione di GLUT4 in vettori vescicolari che traslocano GLUT4 tra compartimenti intracellulari.
L’interazione della coda citoplasmatica di sortilina con retromer e varie proteine adattatrici è stata ben documentata. Tuttavia, l’associazione di sortilina per GLUT4 (e molti dei suoi altri ligandi di proteina) è stato impegnativo per dimostrare. In particolare, i tentativi di co-immunoprecipitate sortilina e GLUT4 non hanno avuto successo probabilmente a causa della natura sensibile detergente dell’interazione tra queste due proteine. Inoltre, come una proteina di trasporto tipico, GLUT4 ha 12 domini transmembrane e 6 anelli di luminal qualsiasi combinazione di cui potenzialmente può rappresentare un luogo sortilina-legante. Allo stesso tempo, un grande corpo di prova indiretta, ad esempio la sostanziale co-localizzazione nella cella, cross-linking con membrana permeabile DSP e l’interazione in due sistema ibrido del lievito suggeriscono che sortilina può associare a GLUT4. Inoltre, utilizzando l’approccio di quest’ultimo in combinazione con l’alanina scansione mutagenesi, precedentemente abbiamo determinato che il dominio di Vps10p di sortilina lega principalmente per il primo ciclo di luminal di GLUT4. Tuttavia, la prova di tale interazione in cellule di mammifero è scomparso. Qui, abbiamo isolato sortilina His-tag da cellule trasfettate 3T3-L1 con la resina cobalto e ha dimostrato che può interagire con peptide sintetizzato chimicamente corrispondente per il primo ciclo di luminal di GLUT4 pH 6 e pH 8 simile milieu acide nella endosomal lumen e ambiente neutro nel lume delle membrane TGN. Nessuna associazione di peptide è stata rilevata in esperimenti di controllo cui estratto preparato da cellule trasfettate con non è stato caricato sui branelli stessi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sortilina è un recettore di evolutiva conservata multi-ligando proteina che è coinvolta in entrambi segnalazione alla membrana del plasma e intracellulare ordinamento eventi6,7. Tuttavia, la ricerca di ligandi di sortilina autentico (alcuni dei quali sono proteine di membrana luminale o integrale) è complicata come l’interazione di sortilina con alcuni dei suoi partner di associazione sembra essere sensibili ai detersivi. Di conseguenza, un facile e un approcc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata sostenuta da sovvenzioni di ricerca DK52057 e DK107498 dal NIH per Carolina X.P è stata sostenuta dalla formazione istituzionale grant 2T32DK007201 da NIH.
Materials
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8849 | for use in purification of histidine tag protein |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1mL Insulin Syringe U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23228 | |
| Wash buffer | Boston BioProducts | BP-234 | For His-tag protein purification |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine sample Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | with SDS, bMercaptaethanol should be added |
| Elution Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | For seperation of peptide and small protein |
| Tris/Tricine/SDS running buffer | Bio-Rad | 161-0744 | |
| Transfer Buffer | Boston BioProducts | BP-190 | Add 20% methanol |
| Nitrocellulose membrane 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | BSA |
| Anti Myc antibody | Cell Signaling | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | customize ordering | |
| Precision Plus Protein Dual color Standarts | BioRad | 161-0374 |
References
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