بروتوكول عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات الماوس ومن تفعيل اللاحقة في المختبر مع مجمعات محصنة ضد الورم
Summary
DC المشتقة من الوحيدات (مودك) يمكن الشعور بمبالغ صغيرة من الجزيئات المرتبطة بالخطر ويتم ذلك بسهولة جاهزة للانفجار. نحن نقدم بروتوكول مفصل لعزل مودك من الدم والأورام ومن التفعيل مع مجمعات محصنة مع تسليط الضوء على الاحتياطات الرئيسية التي يجب أن تعتبر تفاديا من تفعيل سابق لأوانه.
Abstract
الخلايا الجذعية (DC) هم سكان الخلية غير المتجانسة التي تختلف في علامات غشاء الخلية وأنماط الهجرة والتوزيع، وفي عرض مستضد وخلية T تفعيل القدرات. منذ تلقيح معظم النماذج التجريبية الورم تتطلب ملايين العاصمة، معزولة على نطاق واسع من النخاع العظمى أو الطحال. بيد أن هذه العاصمة كثيرا تختلف من الدم وورم DC في ردودهم مجمعات محصنة (IC)، ويفترض أن مستقبلات يكتين Syk-إلى جانب الأخرى. الأهم من ذلك، نظراً لحساسية DC للجزيئات المرتبطة بالخطر، على وجود اندوتوكسينس أو الأجسام المضادة التي مستقبلات التنشيط التشعب في عزل الخطوات يمكن أن يؤدي فتيلة العاصمة وتؤثر بالتالي المعلمات، أو على الأقل الجرعة المطلوبة لتفعيلها. ولذلك، هنا يصف لنا بروتوكول مفصل لعزل مودك من الدم والأورام مع تجنب من تفعيل سابق لأوانه. وبالإضافة إلى ذلك، يتم توفيرها بروتوكولا لتفعيل مودك مع الورم IC، وتحليلاتها اللاحقة.
Introduction
منذ اكتشافهم، كانت الخلايا الجذعية (DC) تركيز بحوث واسعة النطاق بسبب قدرتها الفريدة على الانحراف تمايز الخلية تي1. على مدى العقود العديدة الماضية، سعى مسعى بحوث مستفيضة لتحديد مجموعات فرعية العاصمة المختلفة ووظيفتها أثناء تطور الورم وحصانة 2. وحدات تحكم المجال Dc تتألف من السكان خلية غير المتجانسة التي تختلف عن بعضها البعض في تلك المستقبلات التعرف على الأنماط، توزيع الأنسجة، والمهاجرة ومستضد العرض التقديمي قدرات3،،من45. بالمقارنة مع سائر المجموعات الفرعية في العاصمة، العاصمة المشتقة من الوحيدات (مودك) هي الآن أكثر وفرة في الأورام ويمكن إنشاؤها بسهولة من تعميم أو التسلل إلى الورم وحيدات6،7. ولذلك، تستند العديد من التجارب السريرية التي تسعى إلى الاستفادة من انتشارها النسبي التلاعب في فيفو و السابقين فيفو من مودك الذاتي بغية الحصول على خلية T الحصانة 8،9.
وبالمثل، يتطلب التلقيح المستندة إلى العاصمة من النماذج التجريبية الورم حقن المسلسل 2-3، 5-7 أيام على حدة، من 1-2 × 106 DC المنشط نابض مع المستضدات الورم. ولذلك، ولتحقيق هذا العدد الكبير من العاصمة، معظم الدراسات الماوس أساسا استخدمت مودك مثقف من السلائف نخاع العظم (بي أم) في GM-CSF لمدة 7-9 أيام (إيل-4 غير مطلوبة في إعداد الماوس)10،11. على الرغم من ذلك، نظراً لخروج المغلوب GM-CSF أن الفئران قد حجرة DC عادي عموما 12،13، وإعطاء السكان المختلطة التي تم الحصول عليها من تلك الثقافة،14 الفسيولوجية أهمية هذه العاصمة قد تم التشكيك.
وبدلاً من ذلك، قد تكون معزولة بشكل روتيني DC من خلايا الطحال. ومع ذلك، تشمل العاصمة فقط حوالي 0.3-0.8 ٪ من مجموع الطحال الخلايا (أسفر عن حوالي 7 × 105 DC/الطحال)، وهذه الخلايا، إلا CD103+ العاصمة ومودك يمكن أن يهاجر مرة أخرى إلى الأجهزة اللمفاوية. منذ مودكس يشكلون حوالي 10-15% من سكان العاصمة الطحال15،16، تحقق معظم عزل البروتوكولات حوالي 1 × 105 مودك في الطحال. ويمكن تحقيق التوسع في مودك عن طريق حقن الخلايا B16 transfected التي تفرز GM-CSF، أدى إلى زيادة 100-fold في الطحال مودك17. استخدام مودك لتطوير لقاحات DC غير محدودة إذ لا يمكن أن يتم هذا الإجراء في البشر، وتم الحصول عليها فعلا عالية يتم تنشيط مودك.
بالإضافة إلى الحصول على عدد كاف من العاصمة، ينطوي على تحد آخر لتطوير لقاحات فعالة العاصمة ضد الخلايا السرطانية ذاتي عدم وجود إشارات الخطر كافية في تحديد الورم تنشيط العاصمة بالكامل. وعادة ما يتحقق الاستقراء إشارات كوستيمولاتوري من خلال تنشيط المستقبلات التعرف على الأنماط (بر)، أو يكتين ج-نوع الإشارات مسارات18،19،،من2021. نهج آخر لتنشيط العاصمة يستغل قدرتهم على تناول المضادات عن طريق التفاعل مع مستقبلات Fcγ السطحية (FcγR). وفي الواقع، قد أظهرت عددا من المخطوطات الهامة أن حقن مودك من السلائف BM المنشط مع الورم-مفتش IC يمكن أن تمنع نمو الأورام في إعدادات الاتقائية، ويمكن أن يؤدي إلى استئصال أورام ثابتة22،23 .
في ورقتي الأخيرة، اكتشف الكرمي وآخرون على النقيض من بمدك والطحال DC، مودك من الدم والأورام لا يمكن الاستجابة لمفتش IC دون منشطات إضافية. تم العثور على هذا أن تكون بسبب وجود ارتفاع مستويات تيروزين phosphatases تنظيم إشارات24،25FcγR داخل الخلايا. عن طريق تحديد نقطة حرجة في العاصمة، قدم هذا العمل نظرة ثاقبة هامة في متطلبات التطعيم الناجحة المستندة إلى العاصمة. الحاجة إلى حوافز إضافية لتمكين FcγR الإشارات، ويفترض أنه إشارة من مستقبلات يكتين الأخرى الاستفادة من سلسلة الفسفرة مماثلة، مما يؤكد الحاجة إلى تجنب فتيلة العاصمة خلال عزلتها.
ولذلك، هذا البروتوكول يصف عزلة مودك من الدم والأورام، والتي تختلف بشكل ملحوظ من BM والطحال DC، ويسلط الضوء على احتياطات جديرة بالنظر فيها أثناء العملية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظراً للعدد الكبير من العاصمة اللازمة لتطعيم الفئران (حوالي 2-4 × 106 العاصمة الواحدة وماوس واحد)، ومعظم التلقيح تستند الاستراتيجيات في الفئران إلى عزل العاصمة من BM والطحال متبوعاً التنشيط السابقين فيفو . ومع ذلك، يحاول تنشيط الورم DC في فيفو، استخدام نفس الشروط لتنشيط الطحال …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
لا شيء
Materials
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
References
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
- Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
- Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165 (2014).
- Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
- Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
- Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
- Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
- Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
- Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
- Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
- Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
- Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
- Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
- Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
- Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
- Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020 (2016).
- Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
- Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
- Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
- Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
- Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
- Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
- Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
- Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
- Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
- Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).
