Protocollo di isolamento del Mouse cellule dentritiche monocito-derivate e loro attivazione successiva In Vitro con tumore immunocomplessi
Summary
Monocito-derivate DC (MoDC) può percepire la minor quantità di molecole associate al pericolo e sono pertanto facilmente innescato. Forniamo un protocollo dettagliato per l’isolamento di MoDC da sangue e tumori e la loro attivazione con complessi immuni evidenziando le principali precauzioni che dovrebbero essere considerate al fine di evitare loro attivazione prematura.
Abstract
Le cellule dendritiche (DC) sono popolazioni eterogenee delle cellule che differiscono nella loro membrana cellulare marcatori, modelli di migrazione e distribuzione e nella loro presentazione dell’antigene e la capacità di attivazione delle cellule T. Poiché la maggior parte delle vaccinazioni di modelli sperimentali di tumore richiedono milioni di DC, sono ampiamente isolate dal midollo osseo o milza. Tuttavia, questi DC differiscono significativamente da sangue e tumore DC nelle loro risposte di immunocomplessi (IC) e presumibilmente di altri recettori lectinici Syk-accoppiato. D’importanza, data la sensibilità della DC a molecole associate al pericolo, la presenza di endotossine o anticorpi che passi crosslink recettori di attivazione in una dell’isolamento potrebbe provocare l’innesco della DC e incidere, di conseguenza i parametri, o almeno il dosaggio, richiesto per attivarli. Di conseguenza, qui descriviamo un protocollo dettagliato per isolare MoDC da sangue e tumori, evitando loro attivazione prematura. Inoltre, è fornito un protocollo per l’attivazione di MoDC con tumore IC e loro analisi successive.
Introduction
Fin dalla loro scoperta, le cellule dendritiche (DC) sono stati un fuoco di approfondite ricerche a causa della loro capacità unica di inclinare di differenziazione delle cellule T1. Nel corso degli ultimi decenni, uno sforzo di ricerca ha cercato di definire i vari sottoinsiemi di DC e la loro funzione durante la progressione del tumore e immunità 2. DCs sono composte da popolazioni eterogenee delle cellule che differiscono gli uni dagli altri in loro recettori di riconoscimento di pattern, distribuzione tissutale, e migratori e antigene presentazione funzionalità3,4,5. Rispetto alla altre sottopopolazioni di DC, DC monocito-derivate (MoDC) sono molto più abbondanti nei tumori e può essere facilmente generato da circolanti o tumore-infiltrazione monociti6,7. Pertanto, molti studi clinici che cercano di trarre vantaggio della loro prevalenza relativa si basano sulla manipolazione in vivo ed ex vivo di MoDC autologo per provocare l’immunità delle cellule T 8,9.
Allo stesso modo, DC-based vaccinazione dei modelli sperimentali del tumore richiede 2-3 iniezioni seriale, 5-7 giorni di distanza, di 1-2 x 106 DC attivate ha pulsato con gli antigeni tumorali. Quindi, per ottenere questo grande numero di DC, maggior parte degli studi del mouse sono usati principalmente MoDC coltivate dai precursori del midollo osseo (BM) in GM-CSF per 7-9 giorni (IL-4 non è necessaria nella cornice del mouse)10,11. Tuttavia, dato che knockout di GM-CSF topi hanno nel complesso normale DC vano 12,13e dato le popolazioni miste ottenute da quella cultura,14 la rilevanza fisiologica di questi DC è stata messa in discussione.
In alternativa, la DC può essere ordinariamente isolato da cellule della milza. Tuttavia, la DC comprendono solo circa 0.3-0.8% delle cellule di totale della milza (con conseguente circa 7 x 105 DC/milza) e di queste cellule, solo CD103+ DC e MoDC possono migrare indietro in organi linfoidi. Poiché MoDC contengono circa 10-15% splenica DC popolazioni15,16, maggior parte dei protocolli di isolamento resa di circa 1 x 105 MoDC per milza. Espansione di MoDC può essere realizzato iniettando cellule trasfettate B16 che secernono GM-CSF, con un aumento di 100 volte in splenica MoDC17. Tuttavia, l’uso di MoDC per lo sviluppo di vaccini DC è limitato dal momento che questa procedura non può essere fatto in esseri umani ed l’ottenuti MoDC sono già altamente attivato.
Oltre a ottenere un numero adeguato di DC, un’altra sfida per lo sviluppo di vaccini DC efficaci contro le cellule tumorali autologhe comporta la mancanza di sufficienti segnali di pericolo nella regolazione del tumore per attivare completamente la DC. Induzione di segnali co-stimolatori avviene solitamente attraverso l’attivazione di recettori di riconoscimento di pattern (PRR), o lectine di tipo c segnalazione vie18,19,20,21. Un ulteriore approccio per l’attivazione di DC sfrutta la loro capacità di assumere gli antigeni attraverso l’interazione con recettori di superficie fcy (FcγR). Infatti, una serie di importanti manoscritti hanno indicato che l’iniezione di MoDC dai precursori BM attivato con tumore-IgG IC può prevenire la crescita tumorale nelle impostazioni di profilattiche e può portare all’eliminazione di tumori stabiliti22,23 .
In due recenti articoli, Carmi et al ha scoperto che a differenza di BMDC e milza DC, MoDC dal sangue e tumori non può rispondere a IgG IC senza ulteriori stimoli. Questo è stato trovato per essere dovuto la presenza di alti livelli intracellulari di fosfatasi tirosina che regolano FcγR24,25di segnalazione. Definendo un punto di controllo critico in DC, questo lavoro fornito uno spaccato importante i requisiti per la vaccinazione di successo basato su DC. L’esigenza di ulteriori stimoli attivare FcγR segnalazione e presumibilmente segnalazione da altri recettori lectinici utilizzando una cascata di fosforilazione simile, così sottolinea l’esigenza di evitare l’innesco della DC durante il loro isolamento.
Pertanto, il presente protocollo descrive l’isolamento di MoDC da sangue e tumori, che differiscono notevolmente da BM e milza DC, ed evidenzia le precauzioni da prendere in considerazione durante il processo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dato il gran numero di DC necessaria per vaccinare i topi (circa 2-4 x 106 DC per un topo), la maggior parte della vaccinazione strategie nei topi si basano sull’isolamento di DC da BM e milza seguita da loro attivazione ex vivo . Tuttavia, i tentativi di attivare tumore DC in vivo, utilizzando le stesse condizioni per l’attivazione della milza e BM DC, spesso rimaste soccombenti nella produzione efficace immunità. In due successive pubblicazioni, Carmi et al. hanno trovato che sang…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nessuno
Materials
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
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