マウス単球由来樹状細胞とその後続の in Vitro活性化腫瘍免疫複合体との隔離のプロトコル
Summary
単球由来 DC (研) は危険性関連分子のマイナーな量を感じることができるし、簡単にプライミング、したがって。血液、腫瘍、彼らの早期活性化を避けるために考慮すべき重要注意事項を強調しながら免疫複合体とその活性化から研の隔離のための詳しいプロトコルを提供します。
Abstract
樹状細胞 (DC) が、細胞膜マーカー、移行パターン分布と抗原提示、T 細胞活性化能力で異なる異種細胞集団です。実験腫瘍モデルのほとんどの予防接種は、DC の数百万人を必要とするので、彼らは広く骨髄や脾臓から分離されます。ただし、これらの DC は免疫複合体 (IC) に、おそらく他の Syk 結合レクチン受容体に血および腫瘍 DC の応答から大きく異なります。重要なは、危険準の分子に DC の感度を与え、また内毒素や手順を特定の 1 つの架橋活性化受容体抗体の存在が DC のプライミングにおける結果し、パラメーター影響を及ぼします少なくとも投与量は、それらをアクティブにする必要があります。したがって、ここでは血液・腫瘍からの早期活性化を回避しながら研を分離するための詳しいプロトコルを記述します。さらに、腫瘍 IC、研の活性化とそれに続く分析のためのプロトコルが提供されます。
Introduction
彼らの発見以来、樹状細胞 (DC) は、T 細胞分化1をスキューするユニークな能力のための広範な研究の焦点をされています。過去数十年にわたって広範な研究努力は腫瘍の進行および免疫2中様々 な DC サブセットとその機能の定義を求めています。パターン認識受容体、組織分布の異なる異種細胞集団から成る Dc や渡り鳥と抗原提示機能3,4,5。他の DC サブセットに比べると、単球由来 DC (研) がはるかに多い腫瘍で、循環から簡単に生成することができますまたは腫瘍浸潤単球6,7。したがって、彼らの相対的な感染率の活用を求めている多くの臨床試験は、T 細胞免疫8,9を引き出す自己研の体内と体外の操作に基づいています。
同様に、実験的腫瘍モデルの DC ベースの予防接種が必要です 2-3 シリアル注射、離れて 1-2 × 10 の 5-7 日間6アクティブ DC パルスと腫瘍抗原。したがって、DC のこの大規模な数を達成するためにほとんどのマウスの研究が主に研 (IL-4 マウスの設定不要) 7-9 日間 GM-CSF の骨髄 (BM) 前駆体から培養を使用10,11。それにもかかわらず、全体的に通常 DC コンパートメント12,13マウスが GM-CSF knockout を与えられ、その文化から得られた混合集団を与えられた14これらの DC の生理学的な関連性を質問に呼ばれてきた。
また、DC は、脾臓細胞から日常的に分離することが。ただし、DC 構成は約 0.3 0.8% (約 7 × 105 DC/脾臓の結果)、合計の脾細胞と CD103 のみ、これらの細胞の+ DC と研戻るリンパ器官に移行できます。MoDCs 脾 DC 集団15,16の約 10-15% を構成する、のでほとんどの隔離のプロトコルは約 1 × 105研脾臓あたりをもたらします。研の拡大は、GM-CSF、脾研17100 増加を分泌する transfected の B16 細胞を注入することにより実現できます。しかし、研の DC ワクチンを開発するための使用は限られた人間で得られたこの手順が行われることはできませんので研は既に高度に活性化します。
DC の十分な番号を取得、に加えて自家癌細胞に対して効果的な DC ワクチンの開発の別の課題は、完全に DC をアクティブに腫瘍の設定で十分な危険信号の不足を含みます。共刺激シグナルの誘導は通常パターン認識受容体 (PRR)、または c 型レクチン シグナリング細道18,19,20,21の活性化を介して実現されます。DC の活性化のためのさらなるアプローチは、表面 Fcγ 受容体 (FcγR) との相互作用によって抗原を取る能力を悪用します。確かに、重要な写本の多くを示している予防的設定で、腫瘍の増殖を防ぐことができます BM 前駆体の活性化から研の注入腫瘍-IgG ・ IC と確立された腫瘍22,23の撲滅につながることができます.
2 つの最近の論文で、 Carmi らは、腎不全、脾 DC とは対照的血と腫瘍から研に応答できません IgG IC 追加刺激のないを発見しました。FcγR24,25をシグナル伝達を調節するチロシン脱燐酸化酵素の高い細胞内レベルの存在に起因するとこれが見つかりました。、DC の重要なチェックポイントの定義によっては、この作品は成功した DC ベースの予防接種についての重要な洞察を提供しました。FcγR シグナル伝達とおそらく同様のリン酸化カスケードを利用した他のレクチン受容体から信号を有効にする追加の刺激のための要件はこうして分離中に DC のプライミングを回避する必要性を強調します。
したがって、この議定書は研の血および骨髄および脾臓 DC から著しく異なる、腫瘍からの隔離を記述する、プロセス中に検討に値するの注意を強調します。
Protocol
Representative Results
Discussion
マウスを予防接種に必要な DC の数が多いを与えられた (10 x 約 2-46 DC ごとに 1 つのマウス)、マウスの戦略は BM とex vivo活性化に続いて脾臓から DC の分離に基づく予防接種のほとんど。ただしアクティブ化腫瘍 DC生体内で、活性化する脾臓と BM DC の同じ条件を使用して、多くの場合、効果的な免疫の生産に成功したとされているしようとします。2 つのそれに続く出版物?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
どれも
Materials
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
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