Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri
Summary
Monosit kaynaklı DC (MoDC) tehlike ilişkili molekülleri küçük miktarlarda hissi olabilir ve bu nedenle kolayca astarlanmalıdır. MoDC yalıtım kan ve tümörleri ve onların harekete geçirmek bağışıklık kompleksleri ile onların erken harekete geçirmek önlemek için düşünülmesi gereken önemli önlemler vurgulayarak süre için detaylı bir protokol sağlar.
Abstract
Dendritik hücreler (DC) onların hücre zarı işaretleyicileri, geçiş desen ve dağıtım ve antijen sunumu ve T hücre harekete geçirmek kapasiteleri farklı türdeş olmayan hücre popülasyonlarının vardır. Deneysel tümör modellerin çoğu aşıları DC milyonlarca gerektiren bu yana, dalak ve kemik iliği yaygın olarak izole edilmiştir. Ancak, bu DC önemli ölçüde farklı kan ve tümör verdikleri yanıtlara DC bağışıklık kompleksleri (IC) ve muhtemelen diğer Syk birleştiğinde lektin reseptörleri. Önemlisi, DC duyarlılığını tehlike ilişkili moleküllerin göz önüne alındığında, endotoxins veya crosslink harekete geçirmek reseptörleri birinde yalıtma, adım adım yol gösteren antikor varlığı neden DC astar içinde ve böylece Parametreler etkiler ya da en azından Dozaj, onları harekete geçirmek için gerekli. Bu nedenle, burada biz onların erken harekete geçirmek kaçınırken kan ve tümör oluşmuş MoDC izole için detaylı bir protokol tanımlamak. Buna ek olarak, bir protokol ile tümör IC MoDC harekete geçirmek ve onların daha sonraki analizler için sağlanır.
Introduction
Onların keşif beri dendritik hücreler (DC) kapsamlı bir araştırma T hücre farklılaşması1eğriltmek için benzersiz yetenekleri nedeniyle bir odak noktası olmuştur. Son birkaç on yıl içinde bir kapsamlı bir araştırma çaba tümör ilerleme ve bağışıklık 2sırasında çeşitli DC alt kümeleri ve işlevleri tanımlamak araştırmıştır. DCs onların örüntü tanıma reseptörleri, doku dağıtım, birbirinden farklı türdeş olmayan hücre popülasyonlarının oluşan ve göçmen ve antijen sunumu yetenekleri3,4,5. Diğer DC alt kümeleri için karşılaştırıldığında, monosit kaynaklı DC (MoDC) tümörleri içinde çok daha bol ve döngüye girmesini kolayca oluşturulabilir veya tümör infiltre monosit6,7. Bu nedenle, onların göreceli yaygınlık yararlanmak isteyen birçok klinik T hücre bağışıklık 8,9temin için otolog MoDC vivo içinde ve ex vivo manipülasyon temel alır.
Benzer şekilde, DC-esaslı aşı deneysel tümör modelleri 2-3 seri enjeksiyon, 5-7 gün arayla 1-2 x 10 gerektirir harekete geçirmek DC geniş puls tümör antijenleri ile6 . Bu nedenle, bu sayıda DC elde etmek için çoğu fare çalışmalar öncelikle 7-9 gün (IL-4 Fare ayarlarında gerekli değildir) kemik iliği (BM) GM-CSF kara filmin tarih öncesi gelen kültürlü MoDC kullandım10,11. Yine de, bu GM-CSF nakavt fareler var genel olarak normal DC yuvası 12,13ve o kültürü, elde edilen karışık nüfus göz önüne alındığında14 bu DC fizyolojik alaka soru içine çağrıldı.
Alternatif olarak, DC dalak hücrelerden rutin olarak izole olabilir. Ancak, DC oluşturan yaklaşık 0,3-%0,8 Toplam dalak hücre (yaklaşık 7 x 105 ‘ te DC/dalak kaynaklanan) ve bu hücreler, sadece CD103+ DC ve MoDC lenfoid organlar için geçiş. Dalak DC nüfusu15,16yaklaşık % 10-15 MoDCs oluşturan beri çoğu yalıtım protokolleri yaklaşık 1 x 10-5 MoDC dalak verim. MoDC genişleme GM-CSF, dalak MoDC17100-fold bir artış sonuçlanan salgılar transfected B16 hücreleri enjekte edilerek elde edilebilir. Bu yordamı insanlar ve elde edilen mümkün değil ancak, DC aşı geliştirmek için MoDC kullanımı sınırlı vardır MoDC zaten çok aktif.
Yeterli adet DC elde etmek ek olarak, otolog kanser hücrelerine karşı etkili DC aşı geliştirmek için başka bir sorun tam olarak DC etkinleştirmek için yeterli tehlike sinyalleri tümör ortamda eksikliği içerir. İndüksiyon co-stimulatory sinyal genellikle örüntü tanıma reseptörleri (PRR) veya c tipi lektin sinyal yolları18,19,20,21aktivasyonu ile elde edilir. DC etkinleştirmek için başka bir yaklaşım yeteneklerini antijenleri yüzey Fcγ reseptörleri (FcγR) ile etkileşimleri aracılığıyla almak için kullanır. Gerçekten de, bir dizi önemli el yazmaları göstermiştir MoDC enjeksiyon BM öncüleri harekete geçirmek ile gelen tümör-IC IgG ki tümör büyüme profilaktik ayarlarında engelleyebilir ve kurulan tümörler22,23 ortadan kaldırılması için yol açabilir .
İki son gazetelerde Carmi BMDC ve dalak DC aksine, MoDC kan ve tümör ek uyaranlara karşı IgG IC yanıt veremiyor keşfetti. Bu FcγR24,25sinyal düzenleyen Tirozin fosfatazlar yüksek hücre içi düzeyde varlığı nedeniyle bulundu. DC’de kritik bir denetim noktası tanımlayarak, bu eser başarılı DC-esaslı aşı için gereksinimleri önemli bir içgörü sağladı. Sinyal ve muhtemelen benzer bir fosforilasyon çağlayan kullanan diğer lektin reseptörleri sinyal FcγR etkinleştirmek ek bir çekim gücü gereksinimini böylece DC astar onların yalıtım sırasında kaçınmak gereğini vurgular.
Bu nedenle, mevcut protokol MoDC yalıtım kan ve belirgin BM ve dalak DC farklı, tümör açıklar ve önlemler işlemi sırasında dikkate değer vurgulamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fareler telkih için gerekli DC çok sayıda göz önüne alındığında (yaklaşık 2-4 x 106 DC bir fare başına), farelerde stratejileri yalıtım DC BM ve onların ex vivo harekete geçirmek tarafından takip dalak dayalı aşılamanın en. Ancak, saldırılara tümör DC in vivodalak ve BM DC etkinleştirmek için aynı koşullar kullanarak, etkinleştirmek kez etkili bağışıklık üretiminde başarısız oldu. İki sonraki yayınlarda Karmi ve ark. Onlar doğal olarak yük…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiçbiri
Materials
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE-Healthcare | 17-5442-02 | |
| OptiPrep | StemCell Technologies | 07820 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-052-301 | |
| EasySep Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19861 | |
| Collagenase IV | Sigma | C9697-50MG | Test each lot for endotoxin |
| DNase I | Sigma | DN25-10MG | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| FBS | ThermoFisher | 16140071 | Test each lot for endotoxin |
| PE-CD11c | Biolegend | 117307 | |
| APC-CD11b | Biolegend | 101211 | |
| Brilliant Violet 650 MHCII | Biolegend | 107641 | |
| AF48- CD86 | Biolegend | 105017 | |
| APC/Cy7-Ly-C6 | Biolegend | 108423 | |
| PE/Cy7-CD15 | Biolegend | 135523 |
References
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
- Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
- Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
- Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165 (2014).
- Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
- Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
- Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
- Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
- Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
- Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
- Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
- Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
- Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
- Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
- Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
- Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
- Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
- Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020 (2016).
- Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
- Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
- Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
- Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
- Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
- Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
- Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
- Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
- Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
- Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).
