Summary

Isolation protokol af musen monocyt-afledte dendritiske celler og deres efterfølgende In Vitro aktivering med Tumor immunkomplekser

Published: May 31, 2018
doi:

Summary

Monocyt-afledte DC (MoDC) kan føle mindre mængder af fare-associerede molekyler og er derfor let primet. Vi leverer en detaljeret protokol for dyrkning af MoDC fra blodet og tumorer og deres aktivering med immunkomplekser samtidig fremhæve vigtige forholdsregler, der bør overvejes for at undgå deres for tidlig aktivering.

Abstract

Dendritiske celler (DC) er heterogene cellepopulationer, der adskiller sig i deres cellemembran markører, migrationsmønstre og distribution, og i deres antigen præsentation og T-celle aktivering kapacitet. Da de fleste vaccinationer af eksperimentelle tumor modeller kræver millioner af DC, er de meget isoleret fra knoglemarv eller milt. Disse DC varierer dog betydeligt fra blod og tumor DC i deres svar til immunkomplekser (IC), og formentlig til andre Syk-kombineret lektin receptorer. Vigtigere, givet følsomheden af DC til fare-associerede molekyler, tilstedeværelsen af endotoksiner eller antistoffer der bitmapgenkendelse aktivering receptorer i en af de isolere trin kunne resulterer i priming af DC og dermed påvirke parametrene, eller i det mindste dosering, krævede hen til aktivere dem. Derfor, her vi beskrive en detaljeret protokol til at isolere MoDC fra blodet og tumorer samtidig undgå deres for tidlig aktivering. Derudover tilbydes en protokol for MoDC aktivering med tumor IC, og deres efterfølgende analyser.

Introduction

Siden deres opdagelse, har dendritiske celler (DC) været fokus på omfattende forskning på grund af deres unikke evne til at vride T-celle differentiering1. Over de sidste mange årtier, har en omfattende forskningsindsats forsøgt at definere de forskellige DC delmængder og deres funktion under tumor progression og immunitet 2. DCs er sammensat af heterogene cellepopulationer, der adskiller sig fra hinanden i deres mønstergenkendelse receptorer, væv distribution, og vandrende og antigen præsentation kapaciteter3,4,5. Sammenlignet med andre DC delmængder, monocyt-afledte DC (MoDC) er langt mere rigelige i tumorer og nemt kan genereres fra cirkulerende eller tumor infiltrerer monocytter6,7. Derfor, mange kliniske forsøg søger at drage fordel af deres relative forekomst er baseret på i vivo og ex vivo manipulation af autologe MoDC for at fremkalde T-celle immunitet 8,9.

På samme måde, DC-baserede vaccination af eksperimentelle tumor modeller kræver 2-3 serie injektioner, 5-7 dages mellemrum, 1-2 x 106 aktiveret DC pulserende med tumor antigener. Derfor, for at opnå dette store antal DC, de fleste mus undersøgelser har primært brugt MoDC kulturperler fra knoglemarv (BM) prækursorer i GM-CSF for 7-9 dage (IL-4 ikke er påkrævet i indstillingen mus)10,11. Ikke desto mindre, givet at GM-CSF knockout mus er samlet normal DC rum 12,13, og givet de blandede befolkninger fremstillet af denne kultur,14 fysiologiske relevansen af disse DC har blevet draget i tvivl.

Alternativt kan DC være rutinemæssigt isoleret fra milt celler. Men DC omfatter kun omkring 0,3-0,8% af samlede milt celler (resulterer i ca 7 x 105 DC/milten), og af disse celler, kun CD103+ DC og MoDC kan vandre tilbage til lymfoid organer. Da MoDCs omfatter ca. 10-15% af milt DC populationer15,16, give de fleste isolation protokoller ca 1 x 105 MoDC pr. milt. Udvidelse af MoDC kan opnås ved at indsprøjte transfekteret B16 celler, der udskiller GM-CSF, hvilket resulterer i en 100-fold stigning i milt MoDC17. Men brug af MoDC til at udvikle DC vacciner er begrænset, da denne procedure ikke kan gøres i mennesker og de opnåede MoDC er allerede stærkt aktiveret.

Ud over at opnå tilstrækkelig antal DC, indebærer en anden udfordring for at udvikle effektive DC vacciner mod autolog kræftceller manglen på tilstrækkelige faresignaler i indstillingen tumor fuldt aktivere DC. Induktion af co-stimulatory signaler er normalt opnås gennem aktivering af mønstergenkendelse receptorer (PRR), eller c-type lektin signaling veje18,19,20,21. En yderligere tilgang for aktivering DC udnytter deres evne til at tage op antigener gennem interaktioner med overflade Fcγ receptorer (FcγR). En række vigtige håndskrifter har vist, at injektion af MoDC fra BM prækursorer aktiveret hos tumor-IgG IC kan forhindre tumorvækst i profylaktisk indstillinger, og kan føre til udryddelse af etablerede tumorer22,23 .

I to nylige papirer opdagede Carmi et al. , at i modsætning til BMDC og milt DC, MoDC fra blodet og tumorer ikke kan reagere på IgG IC uden yderligere stimuli. Dette blev anset for at være på grund af tilstedeværelsen af høje intracellulære niveauer af tyrosin fosfataser regulerer FcγR signalering24,25. Ved at definere et kritisk kontrolpunkt i DC, gav dette arbejde et vigtigt indblik i kravene til vellykket DC-baserede vaccination. Kravet om for ekstra stimuli for at aktiverer FcγR signalering, og formentlig signalering fra andre lektin receptorer udnytter en lignende fosforylering kaskade, understreger således behovet for at undgå priming af DC under deres isolation.

Derfor, denne protokol beskriver isolation af MoDC fra blodet og tumorer, som afviger markant fra BM og milt DC, og fremhæver forholdsregler værd at overveje i løbet af processen.

Protocol

Protokollerne nedenfor henviser til isolering af mus MoDC, men de overordnede principper der kan gælde andre DC delmængder celler samt. 12 – 16-uge-forhenværende C57Bl/6j mus blev opretholdt i en American Association for akkreditering af Laboratory Animal Care-akkrediteret animalske faciliteten. Alle protokollerne godkendtes ved Stanford University og Tel Aviv Universitet institutionelle Animal Care og brug udvalget. 1. isolering af Tumor forbundet monocyt-afledte DC I en laminar …

Representative Results

Vi sammenlignede oprindeligt antistoffer fra naiv syngeneic og allogen mus evne til at binde til tumorceller. Med henblik herpå, blev B16F10 og LMP tumor cellelinjer fast i PARAFORMALDEHYD og vasket grundigt. B16F10 er et melanom cellelinie, som blev oprindeligt isoleret fra lungemetastaser i C57Bl/6 mus. LMP er en pancreas tumor celle, der blev isoleret fra KrasG12D / + LSL-Trp53R172H / + og Pdx-1-Cre mus, og vokser støt i 129F1 mus. For at opnå IC, blev tumorceller udruget i 20 min. …

Discussion

Betragtning af det store antal DC kræves for vaccinering mus (ca 2-4 x 106 DC pr. en mus), de fleste af vaccination strategier i mus er baseret på dyrkning af DC fra BM og milt efterfulgt af deres ex vivo -aktivering. Men forsøg at aktivere tumor DC i vivo, ved hjælp af de samme betingelser for aktivering af milt og BM DC, ofte har været mislykket i at fremstille effektive immunitet. I de to efterfølgende publikationer, Carmi mfl. har fundet, at blod og tumor MoDC afviger betyd…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ingen

Materials

Ficoll-Paque PREMIUM GE-Healthcare 17-5442-02
OptiPrep StemCell Technologies 07820
CD45 MicroBeads Miltenyi 130-052-301
EasySep Monocyte Isolation Kit StemCell Technologies 19861
Collagenase IV Sigma C9697-50MG Test each lot for endotoxin
DNase I Sigma DN25-10MG
HBSS ThermoFisher 14025092
FBS ThermoFisher 16140071 Test each lot for endotoxin
PE-CD11c Biolegend 117307
APC-CD11b Biolegend 101211
Brilliant Violet 650 MHCII Biolegend 107641
AF48- CD86 Biolegend 105017
APC/Cy7-Ly-C6 Biolegend 108423
PE/Cy7-CD15 Biolegend 135523

References

  1. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
  2. Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
  4. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
  5. Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
  6. Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
  7. Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
  8. Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
  9. Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165 (2014).
  10. Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
  11. Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  12. Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
  13. Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
  14. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
  15. Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
  16. Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
  17. Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
  18. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
  19. Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
  20. Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
  21. Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
  22. Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
  23. Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
  24. Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
  25. Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020 (2016).
  26. Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
  27. Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
  28. Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
  29. Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
  30. Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
  31. Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
  32. Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
  33. Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
  34. Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
  35. Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
  36. Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).
check_url/kr/57188?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Santana-Magal, N., Rasoulouniriana, D., Saperia, C., Gutwillig, A., Rider, P., Engleman, E. G., Carmi, Y. Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes. J. Vis. Exp. (135), e57188, doi:10.3791/57188 (2018).

View Video