اثنين-فوتون تصوير إينترافيتال من الكريات البيضاء خلال الاستجابة المناعية في الكبد تعامل Lipopolysaccharide الماوس
Summary
قمنا بإنشاء بروتوكول جراحية رواية لتصوير اثنين-فوتون من كبد الفئران حية مع الحد الأدنى من الغزو. مع هذا الأسلوب، حددنا الهيكل التفصيلي للكبد خلال اندوتوكسيميا الناجمة عن lipopolysaccharide. ونحن نتوقع أن يمكن استخدام هذا الأسلوب تحديد مدى فعالية العلاج الكواشف المختلفة لهجرة الكريات البيض الكبد.
Abstract
تعفن الدم هو نوع من العدوى الحادة التي يمكن أن تتسبب في فشل الأعضاء والأنسجة، والضرر. على الرغم من أن معدلات الوفيات والإصابة بالأمراض المرتبطة الانتان هي العلاج مرتفعة للغاية، لا مباشرة أو الآلية المتصلة بالجهاز وقد درست بالتفصيل في الوقت الحقيقي. الكبد هو الجهاز الرئيسي الذي يتحكم بالسموم والالتهابات في جسم الإنسان. هنا، نحن بهدف القيام بتصوير إينترافيتال للكبد الماوس بعد تحريض اندوتوكسيميا من أجل تتبع الحركية الخلايا المناعية، مثل العَدلات والكبد الضامة الحافظة (LCMs). وبناء على ذلك، قمنا بتصميم طريقة جراحية رواية للتعرض للكبد مع الحد الأدنى من جراحة. تم حقن الفئران إينترابيريتونيلي lipopolysaccharide (LPS)، الذيفان مشتركة. استخدام النهج الجراحية رواية للتعرض والتصوير إينترافيتال لتعيين الماوس الكبد، وجدنا أن العَدلات في المعالجة بلبس ليسم-أخضر نيون البروتين (التجارة والنقل) والماوس الكبد زيد مقارنة مع ذلك في مخزنة الفوسفات الكبد المعالجة بالمياه المالحة. بعد العلاج لبس، زيادة عدد العَدلات كبيرة مع مرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام الفئران CX3Cr1-التجارة والنقل، ونحن بنجاح تصور الضامة المقيم الكبد تسمى لكمس. ولذلك، للتحقيق في كفاءة الكواشف الجديدة للتحكم في التنقل محصنة في فيفو، تحديد حركية ومورفولوجيا العَدلات ولكمس في الكبد قد تسمح لنا بتحديد التأثير العلاجي في الجهاز فشل والأنسجة، والأضرار التي تسببها تنشيط الكريات البيضاء في الانتان.
Introduction
الكبد هو الجهاز الأيضية الرئيسية في الثدييات؛ أنها بمثابة برج مراقبة ل الطاقة والهرمونات والسموم1. نظراً لأهميته، وقد أجرى الباحثون العديد من التجارب في المختبر و في فيفو توضيح التغيرات في الكبد أثناء التهاب. وقد استخدمت الفحص المجهري إينترافيتال لالتقاط صور حية من الكبد2 . وفي الواقع، قدم الكبد مختلف أساليب التصوير منذ2،،من34،،من56. ومع ذلك، بغية وضع نهج مبسطة أكثر العمليات جراحية وتحقيق الاستقرار للجهاز المستهدف والخلايا المناعية، قمنا بتصميم بروتوكول بسيطة التي يمكن أن توجه الباحثين التقليل من جهودهم لتصوير إينترافيتال.
في هذه الدراسة، ونحن أدخلت غرفة التصوير مستقرة والرواية وتقنية جراحية يمكن استخدامها للتقليل من الإصابات نزيف وممكن. وأكد نحن أن الكبد لا تزال سليمة لأكثر من 2 ح. مع هذا الأسلوب، وحددنا بنجاح مورفولوجيس لكمس7 والعدلات تحت ظروف الصرف الصحي. حيث يقلل هذا الأسلوب عوامل الخلط الفيزيائي والبيولوجي مثل التهاب يرتجف وغير متوقعة أثناء إجراء العمليات الجراحية، ونتوقع أنه يمكن استخدام هذا الأسلوب لمراقبة ردود فعل حادة من الخلايا المناعية في الكبد ردا على مثل الكواشف لبس.
Protocol
Representative Results
Discussion
ودرست بنشاط الكبد بالعديد من المجموعات3،10، نظراً لأهمية وظيفتها. على سبيل المثال، اقترح هيمان وآخرون طريقة حساسة باستخدام [اغروس]. على الرغم من أن هذا الأسلوب عثر على وجه الدقة العالية، الإعداد [اغروس] يستغرق وقتاً طويلاً. بيد مع منهجيتنا، جميع الإجراءات يم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان يؤيد هذه الدراسة بمنحه مقدمة من الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تموله حكومة كوريا (مسيب؛ ومنحة رقم 2016R1A2B4008199 Y-م. حاء)، ووزارة الصحة والرعاية الاجتماعية، جمهورية كوريا (منح رقم: HI14C1324).
Materials
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
References
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303 (2015).
- Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).
