En snabbt Silver färgning protokoll möjliggör enkel och effektiv upptäckt av SSR markörer med en icke-denatureringen polyakrylamidgel
Summary
Vi rapporterar här, enkel och billig silver färgning protokoll som kräver endast tre reagenser och 7 min behandling, och lämpar sig för snabb generering av hög kvalitet SSR data i den genetiska analysen.
Abstract
Enkel sekvens upprepa (SSR) är en av de mest effektiva markörer som används i växt- och genetisk forskning och molekylär avelsprogram. Silverfärgning är en allmänt använd metod för detektion av SSR markörer i en polyakrylamidgel. Konventionella protokoll för silverfärgning är dock tekniskt krävande och tidsödande. Som många andra biologiska laboratorium har tekniker, silver färgprotokoll stadigt optimerats för att effektivisera upptäckt. Här rapporterar vi förenklade silver färgning metod som avsevärt minskar kostnaderna för reagens och förbättrar detektion upplösning och bildkvalitet tydligheten. Den nya metoden kräver två stora steg (impregnering och utveckling) och tre reagenser (silvernitrat, natriumhydroxid och formaldehyd), och endast 7 min behandling för en icke-denatureringen polyakrylamidgel. Jämfört med tidigare rapporterade protokoll, denna nya metod är enklare, snabbare och använder färre kemiska reagenser för SSR upptäckt. Därför gynnar detta enkla, Billiga och effektiva silver färgning protokoll genetisk kartläggning och markör-assisted avel av en snabb generering av SSR markör data.
Introduction
Utvecklingen av PCR-baserade markörer har revolutionerat vetenskapen om växtgenetik och avel1. Enkel sekvens upprepade (SSR) markörer är bland de vanligaste och mest mångsidiga DNA-markörerna. Deras breda genomet täckning, överflöd, genomet specificitet och repeterbarhet är några av fördelarna med SSR markörer utöver sin codominant arv för detektion av heterozygot genotyper2. Flera studier har använt SSR markörer att undersöka genetisk mångfald, spåra anor, konstruera genetisk koppling kartor och karta gener för ekonomiskt viktiga drag3,4.
PCR-produkter av SSR markörer skiljs vanligen använda agaros eller polyakrylamid gel elektrofores och sedan visualiseras med silverfärgning eller under UV-ljus efter färgning med etidiumbromid. Silverfärgning av DNA-fragment i polyakrylamidgeler är känsligare än andra färgning metoder5,6 och har använts i stor utsträckning att upptäcka DNA-fragment som SSR markörer7.
Som många biologiska laboratorietekniker, har silverfärgning av polyakrylamidgeler stadigt förbättrats sedan dess första rapporteras som en fragment visualisering teknik i 19798. Tekniken ändrades initialt för upptäckt av DNA-fragment av Bassam o.a. 6 1991 och sedan förbättras genom Sanguinetti och medarbetare9 1994. Metoden har optimerats ytterligare sista några decennier6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. de flesta av dessa uppdaterade versioner av protokollen har dock vissa nackdelar såsom hög teknisk efterfrågan och långa handläggningstiden för fixering och montering6, som begränsa tillämpningen av dessa protokoll7, 11. En optimal protokoll som kombinerar låg kostnad med hög verkningsgrad för DNA fragment upptäckt behövs omgående för rutinmässiga tillämpningen av silver färgning i biologisk forskning.
Dessutom Polyakrylamidgelen kan delas in i denatureringen och icke-denatureringen polyakrylamidgeler, och båda kan användas för detektion av SSR markörer använder silver färgning metod. Effekten av och upplösning som avsevärt skiljer sig inte, men icke-denatureringen polyakrylamidgeler är lättare att bearbeta och ta mindre tid16.
På grundval av den tidigare forskningen15är syftet med den aktuella studien att beskriva en optimerad silver färgning protokoll i detalj för snabb, enkel och billig upptäckt av SSR markörer i en icke-denatureringen polyakrylamidgel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tvättning av gel efter impregnering är ett viktigt steg. Otillräcklig tvätt tid och vatten volym kan orsaka ofullständig avlägsnande av impregnering lösning på ytan av plattan och gelen, och resultera i en mörk bakgrund. Utveckla tid är ett annat viktigt steg, överexploatering kan resultera i en mörkbrun bakgrund med låg kontrast bild av DNA-fragment. Dessutom påverkar det impregnering steget avsevärt färgning effektivitet av DNA-fragment. Trots att förlänga impregnering tiden över 5 min eller öka AgN…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av den Guangdong naturvetenskap Foundation i Kina (2015A030313500), den provinsiella nyckel internationella Cooperative Research Platform och stora vetenskapliga forskning projekt av Guangdong högre utbildning (2015KGJHZ015), vetenskapen och Plan för Guangdong tobak monopolförvaltningen (201403, 201705), vetenskap och teknik Plan i Guangdong i Kina (2016B020201001), den nationella innovationsprojekt utbildning för studenter (201711078001). Omnämnande av varunamn eller kommersiella produkter i denna publikation är endast i syfte att tillhandahålla specifik information och innebär inte rekommendation eller bekräftelse av oss jordbruksdepartementet. USDA är en lika möjligheter leverantör och arbetsgivare.
Materials
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | – | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | – | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | – | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | – | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | – |
References
- Jiang, G. L., Anderson, S. B. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. , 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
- Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
- Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
- Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
- Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
- Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, 915-919 (1994).
- Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
- Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
- An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
- Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
- Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
- Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
- Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
- Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, 1102-1108 (1996).
