약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

요약

여기에 제시 된 프로토콜 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하기 위한 플랫폼을 설명 합니다. 단계별 설명 Ipsc 96 잘 접시에서 hepatocyte 특성을 가진 세포로 분화 하 고 작은 분자에 대 한 잠재적인 치료 활동 화면 셀을 사용 하는 방법을 자세히 제시 합니다.

초록

Hepatocyte 모양의 세포 (HLCs)로 인간 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)를 차별 하는 능력 선된 천 성 간 물질 대사 연구에 새로운 기회를 제공 합니다. 그러나, 잠재적으로 간 질환 치료에 사용 될 수 있는 작은 분자의 id를 지 원하는 플랫폼을 제공 하는 절차 화합물의 수천을 심사와 호환 되는 문화 형식이 필요 합니다. 여기, 우리는 hepatocyte 같은 셀 96-잘 조직 문화 접시에 인간의 Ipsc의 재현 차별화를 허용 하는 완전히 정의 된 문화 조건을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 또한 가족성 콜레스테롤 혈 증 환자에서 발생 하는 iPSC 파생 hepatocytes에서 생산 하는 Apolipoprotein B (APOB) 낮은 화면 화합물 그들의 능력에 대 한 플랫폼을 사용 하 여 제공 합니다. 약물 발견과 호환 되는 플랫폼의 가용성 간에 영향을 주는 질병에 대 한 새로운 치료제를 식별 하는 연구를 허용 해야 합니다.

서론

희귀 한 질병을 대상으로 사용할 수 있는 약물을 확인 성공 심사에 사용할 수 있는 분석 실험의 발달에 의존 합니다. 가설 또는 대상 기반 화면 (역방향 약리학) 유용 합니다, 하지만 질병의 분자 기준의 상세한 이해를 요구. Phenotypic 화면 (클래식 약리학) 생화학 경로 대 한 자세한 이해에 대 한 필요 하지만 대신 질병의 이상 정확 하 게 반영 하는 모델의 개발에 따라. 대상-기반 접근에 대 한 열정에 불구 하 고 FDA 승인 첫-에서-클래스 약물의 분석 공개 phenotypic 스크린 훨씬 더 성공적인¹되었습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 심사 하는 높은 처리량에 대 한 플랫폼을 설정 하 대사 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하 사용 될 수 있다입니다. 여러 생체 외에서 모델 기본 hepatocytes은 세포 및 간 조상 세포²를 포함 하 여 기술 되었다. 그러나, 대부분 이러한 모델의 한계, 있고 정확 하 게 문화에서 대사 간 결함의 이상 정리 수 있습니다 새로운 모델에 대 한 필요가 있다. 최근, 인간의 pluripotent 줄기 세포 유전자 편집 함께 액세스 환자 필요 없이 문화에 희귀 질환의 희귀 한 것도 모델 수 있는 기회를 제공 직접

프로토콜

1. 인간의 문화 유도 만능 줄기 세포

1. 재조합 인간 E Cadherin Fc 융합 단백질 (E-cad-Fc) 또는 다른 행렬 hPSC 문화에 대 한 적합 한 코팅 ⁶
   1. Dulbecco의 Phosphate-Buffered 염 분 칼슘 및 마그네슘 (DPBS (+))와 함께 전자 cad Fc 15 μ g/mL를 희석.
   2. 100 m m 정지 조직 문화 요리 희석된 전자 cad Fc의 5 mL와 코트 및 적어도 1 h. 제거 기판에 대 한 37 ˚C에서 품 어와 매체 (예를 들어, 이제 M 매체 라고는 mTeSR1)의 5 mL을 바꿉니다⁷.
      참고: 이 프로토콜에 사용 되는 배양은 게시 프로토콜⁷다음을 준비 하 고 있다. 그러나, 다른 여러 미디어 준비 설명 되었습니다 또는 사용할 수 상업적으로, 절차와 호환이 되는 가능성이 있습니다.
   3. 액체 질소에서 cryopreserved Ipsc의 유리병을 검색 합니다. 작은 얼음 크리스탈 남아 때까지 37 ˚C에서 해 동. M-중간의 4 mL를 포함 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 세포를....

결과

Hepatocyte의 세대 - 세포 처럼: 그림 1 는 hepatocyte 같은 셀에 인간의 Ipsc의 분화 하는 동안 발생 하는 변경의 기간을 설명 합니다. 전자 Cad Fc에 Ipsc의 문화 제공 약 2 mm 직경 식민지 만능 마커 OCT4 표현 (그림 1A-B). 전자 cadherin 매트릭스에 성장 하는 세포의 형태는 약간 다른 다른 표면에 경작 그 있을 것입니다. 그들은 큰 세포질 표면 영역 (그림 1A)와 병합 된 형태를가지고 경향이 있다. 비록 인간의 pluripotent 줄기 세포 다른 행렬¹¹의 수에 효율적으로 경작 될 수 있다, 전자.......

토론

기반으로 하는 대상 약물 발견, 작은 분자 식별 됩니다 특정 단백질의 활동에 영향을 주는 많은 기존 심사 활동의 초점이 되었습니다. 이 이렇게는 수많은 제약, 반전 형, 고전 학, 바탕 화면을 제공 하 고 있지만 임상 효능¹되었습니다 일등석에서 화합물을 식별 하는 것에 더 성공한 되었습니다. Phenotypic 약물 발견에 단점은 적절 한 질병 모델의 가용성에 의존입니다. 이 질병의 셀 모델을 사용할 수 없을 때 도전이 될 또는 일반적인 연구 동물 종의 임상 증상을 정리 하지 못할 때 수 있습니다. 그러나, 환자의 체세포에서 Ipsc를 생성 하는 기능 문화³모델 인간의 질병에 새로운 기회를 제공 했다. 희귀 유전 질환과 같은 일부 질환, 환자 번호에 액세스 하 고 동의 하기 어려운 몇 될 수 있습니다. 그러나, 게놈 엔지니어링의 도래와 함께 그것은 원인이 돌연변이 희귀 질환의 희귀 한 모델 수 iPSC 게놈으로 소개를 상대적으로 간단 합니다.<.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100mm x 20mm 멸균 조직 배양 접시	Corning	430167
100 mm x 20 mm 멸균 현탁액 배양 접시	Corning	430591
96-웰 조직 배양 플레이트	코닝	3595
항 인간 알부민	Dako	A 0001
항 인간 FOXA2 (6C12)	Novus Biological	H00003170-M12
항 인간 HNF4 알파	산타 크루즈	SC-6556
안티 휴먼 Oct-3/4 항체	산타 크루즈	SC-9081
안티 휴먼 SOX17	R & D	AF1924
Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated	Millipore	FCMAB115F
Activin A 재조합 인간 단백질	Invitrogen	PHC9563
B-27 보충제, 인슐린 제외	Invitrogen	0050129SA
B-27 보충제, 무혈청;	Invitrogen	17504044
BMP4 재조합 인간 단백질	Invitrogen	PHC9533
해리 시약 StemPro  아쿠아타제	Invitrogen	A1110501
CellTiter-Glo 발광 세포 생존율 분석	Promega	7572
DPBS+(칼슘, 마그네슘)	Invitrogen	14040-133
DPBS-(칼슘 없음, 마그네슘 없음)	Invitrogen	14190-144
DMEM/F-12, HEPES	Invitrogen	11330057
ELISA human APOB ELISA 개발 키트	Mabtech	3715-1H-20
섬유아세포 성장 인자 2 (FGF2)	Invitrogen	PHG0023
Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)	Lonza	CC-3198
간세포 성장 인자  (HGF)	인비트로젠	PHC0321
L-글루타민	Invitrogen	25030081
MEM 비필수 아미노산 솔루션	Invitrogen	11140076
Oncostatin M (OSM) 재조합 인간 단백질	인비트로젠	PHC5015
페니실린-스트렙토마이신	Invitrogen	15140163
피더 무료 만능 줄기 세포 배지: mTesR1	STEMCELL Technologies	5850
감소 성장 인자 기저막 매트릭스	Invitrogen	A1413301
RPMI 1640 매체, HEPES	Invitrogen	22400105
StemAdhere 정의 매트릭스 hPSC (E-cad-Fc)	Primorigen Biosciences	S2071
TMB-ELISA 기질 솔루션	Thermo Scientific	34022
Anti-TRA-1-60 FITC conjugated	Millipore	FCMAB115F
Versene (EDTA) 0.02%	Lonza	17-711E
Y-27632 ROCK 억제제	STEMCELL Technologies	72302

세포