수집 및 RNA 분석에 대 한 큰 동물에서 림프절의 처리: 큰 동물 종의 림프 노드 Transcriptomic 연구에 대 한 준비

요약

이 프로토콜은 림프절 조직 식별 하 고 가축과 야생 동물, 샘플링 방법에서 림프절의 절단 단계를 포함 하 여 큰 동물에서의 프로 파일링 transcriptomic RNA의 격리에 대 한 절차의 개요를 제공 사후 수집 보존 및 RNA 분석 처리에 대 한 여러 동물, 그리고 고려 사항 플러스 대표 결과 걸쳐 일관성을 제공 합니다.

초록

큰 동물 (가축과 야생 동물) 동물 매개 병원 체, 세라, 진 균 bovis, 살 모 넬 라, 대장균, 등의 중요 한 공기 통으로 봉사 하 고 pathogenesis의 연구에 대 한 유용 및 자연 호스트에서 박테리아의 확산입니다. 호스트 면역 반응에서 림프절의 핵심 기능으로, 림프절 조직 역할을 다운스트림 transcriptomic 분석에 대 한 RNA의 감염의 과정을 통해 세포에 유전자 발현의 시간적 변화를 평가 합니다. 이 문서는 림프 노드 컬렉션, 조직 샘플링 및 다운스트림 RNA 아메리카 들소 (비 손 비 손에서에서 제공 하는 추가 예제와 함께 모델로, 가축 (보스 토 러 스)를 사용 하 여 가축, 처리 과정의 개요를 선물 한다 ). 프로토콜 시체의 위치, 식별 및 여러 주요 사이트에서 림프절의 제거에 대 한 정보를 포함합니다. 또한, 생 검 샘플링 방법론 여러 동물에서 샘플링의 일관성에 대 한 수 있도록 제공 됩니다. 샘플 보존에 대 한 몇 가지 고려 사항, RNA 시퀀싱 및 RT-PCR 같은 다운스트림 방법론에 대 한 적합 한 RNA의 생성을 포함 하 여 설명 합니다. 큰 동물 대 마우스 시간 과정 연구에 내재 된 긴 지연으로 인해 들소와 소 림프절 조직에서 대표적인 결과의 검토의 맥락에서이 조직 유형에 저하의 시간 과정을 설명 하기 위해 제공 됩니다. 다른 조직에서 RNA 저하에 이전 방법론 작동 합니다. 전반적으로,이 프로토콜은 유용 두 수의 연구에 큰 동물 샘플 transcriptome 프로젝트를 시작 하 고 분자 생물학 조직 샘플링 vivo에서 그리고 생체 외에서 처리 기법을 학습에 관심이 있을 것입니다.

서론

림프절의 transcriptome의 RNA 시퀀싱 분석 병원 체의 다양 한 동물의 면역 반응을 하 기회를 제공 한다. 이 방법론은 생쥐에서 광범위 하 게 이용 되어, 하는 동안 분석은 최근 큰 포유류^1,2로 확대 되었습니다. 가축 또는 큰 동물 림프 노드 호스트 감염 뿐만 아니라 백신 또는 유전 자화 율 연구에 그들의 사용을 위해 그리고 인간 연구에 대 한 모델 시스템으로 서 뿐만 아니라 신약 개발에 대 한 대상의 식별에 대 한 응답 특성을 사용할 수 있습니다. 동물 매개 질병에. 예를 들어 brucellosis (동물 매개 세균성 질병 그 영향은 절반 백만 사람들이 전 세계 매년), 경우에 크게 증가 비용, 연구 양에서 또는 염소는 더 인간 감염 및 인간 백신 관련 실험실 동물 모델 보다 개발입니다. 마우스 감염 모델 정리 reticuloendothelial 시스템 감염 하지만 하지는 특징적인 임상 증상³_.

실험실 동물 연구에 비해 큰 동물 실험에서 조직의 반드시 수확 과정 포함는 안락사의 보존에 대 한 잠재적인 도전을 선물 한다 조직 컬렉션 사이 긴 지연 높은-품질 한 RN....

프로토콜

여기에 묘사 된 동물 검 시 절차 국립 동물 질병 센터, Ames, 아이오와에 승인된 IACUC 프로토콜 적용 모든 실험 동물 보호 및 복지에 대 한 승인 된 지침에 따라 실시 했다.

1. 미리 검 시 전에 계획

1. 전에 검 시 검 시 스위트 전송에 대 한 다음 자료 준비:
   1. 1.5 또는 2 mL microcentrifuge 튜브 가득 ~ 1.0 mL 랙 또는 수송 컨테이너에 RNA 보존 솔루션의. 조직의 볼륨을 보존 솔루션의 볼륨의 비율에 대 한 제조업체의 지침에 따라 해야 합니다.
   2. 일회용 scalpels와 깨끗 한, 압력가 마로 소독 집게: 피부와 림프절 (한 동물 당 각 림프절), 수집 하기 위한 다른 세트를 해 부에 대 한 설정 하나 피부와 림프 노드 환경 식물의 교차 오염을 방지 조직입니다.
   3. 3 m m 사용된 scalpels와 생 검 도구 및 절단 보드와 sharps 컨테이너 또는 림프절 절 개에 사용 하기 위해 일회용 쟁반 생 검 도구, 검 시 칼을 펀치.
   4. PPE는 시스템에 대 한 적절 한 BSL 수준 작업에 필요한을 포함 한 개인 보호 장비를 사용 합니다.
   5. 압력솥 재사용 가능한 금속 도구, 설정 기구/드라이 제품을 사용 하 여....

결과

이 문서 (프로토콜의 단계 1-4)에서 제공 하는 고려를 사용 하 여 호스트 유전자 표현 연구에 다운스트림 분석 적합 큰 동물 샘플에서 RNA의 회복에 도움이 됩니다. 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 RNA 품질은 여러 표준 측정에 의해 평가 됩니다. 분 광 광도 학, 단백질 오염 물질의 측정을 제공 하는 A₂₆₀/A₂₈₀ 비율 및 A₂₆₀/A₂₃₀ 비율 순수성 평가 페 놀 등 화학 오염 물질 감지의 다른 수단을 제공 합니다. 각각의 경우의 비율 ~ 2.0 높은-품질 RNA의 증거 이며 감소 비율 오염의 증거. 중요 한 것은, 이러한 비율 질적으로 평가 될 수 있다 RNA 저하에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다 (4.15-4.17 단계) 및 양적 (4.18를 단계는 RNA를 통해 무결성 번호 또는 린 점수와 같은).

그것은 림프절 조직 섹션에서 복구 하는 RNA의 예상된 품질 수준은, 평균에, 소과.......

토론

마우스, 쥐, 또는 사후 인간의 샘플 transcriptomic 연구와 관련 된 프로토콜의 대부분에 의하여 초점 있다. 그러나, 가축과 야생 동물에 대 한 조사는 인간의 보건에 모두에 적용 가능한 동물 용 의약품, 동물 매개 질병에 관한 질병에 면역 반응의 특성에 대 한 기회의 넓은 범위를 제공합니다. 이 프로토콜은 큰 동물, 가축, 들소, 염소, 양 등에서 높은 무결성 조직에서 RNA 추출에 대 한 주요 고려 사항에 대 한 개요를 제공합니다. 샘플 컬렉션에 대 한 조건 및 동물의 크기는 복구 마우스 림프 노드 복구에 대 한 보다 긴 사후 처리 시간으로 더 광범위 한 프로세스를 확인 합니다. 마찬가지로, 이러한 림프절의 대형 샘플을 대표 림프 노드 내에서 면역/병리학 변화 뿐만 아니라 다른 동물에서 병렬 샘플을 복구 하는 프로토콜을 필요로 합니다. 림프 노드의 단면에 따라 대표 프로필 뿐만 아니라 그대로 RNA의 복구에 대 한 샘플 컬렉션이이 프로토콜에 대 한 제안을 제공 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RNA 보존 용액 (모든 실험에는 RNALater를 사용했습니다)	ThermoFisher	AM7020
1.5 ml 또는 2 ml 폴리프로필렌 마이크로 원심분리기 튜브	Fisher Scientific	05-408-129
일회용 메스	Daigger Scientific	EF7281
조직 겸자, 쥐 이빨	Fisher Scientific	12-460-117	곡선 팁, 테이퍼 가장자리 등을 포함한 기타 조직 겸자 사용 가능, 사용자 선호도에 따라 다름
3mm 펀치 생검 바늘	Fisher Scientific	NC9949469
샤프 용기 (부검을 위해 작고 운반 가능)	Stericycle	8900SA	1 qt. 여기에 표시된 크기
도마 또는 일회용 트레이	Fisher Scientific	09-002-24A	사용자 취향에 따라 다양한 크기로 제공
개인 보호 장비			병원체에 따라 다름 (장갑, 인공 호흡기 마스크, 고글 등)
페놀 기반 RNA 추출 시약(모든 실험에 TRIzol 시약 사용)	ThermoFisher	15596026
실리카 컬럼 기반 RNA 추출 키트(모든 실험에 PureLink RNA Mini 키트 사용)	ThermoFisher	12183018A	최대 100mg 조직용으로 설계됨
100% 에탄올(분자생물학을 위한 200 proof)	Sigma-Aldrich	E7023
동봉 된 균질화 튜브가있는 조직 균질화 기 (모든 실험에 gentleMACS dissociator를 사용했습니다)	Miltenyi Biotec	130-093-235
Agarose (일반, 겔 전기 영동 용)	Sigma-Aldrich	A9539
1X	TBE Fisher Scientific	BP24301	실험실에서 처음부터 만들 수도 있습니다
탈 이온화 포름 아미드	EMD Millipore	S4117
나트륨 도데실 설페이트	시그마-알드리치	L3771
브로모페놀 블루	시그마-알드리치	114391
자일렌 시아놀	Sigma-Aldrich	X4126
EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산)	Sigma-Aldrich	EDS
UV-Vis 분광 광도계 (NanoDrop 분광 광도계 사용)	ThermoFisher	ND-2000
장치(관련 구성 요소 및 프로토콜과 함께 Bioanalyzer 사용)	애질런트	G2939BA
FFPE RNA 추출 키트(포르말린 고정, 파라핀 내장 조직에 대해 RecoverAll 총 핵산 분리 키트를 사용함)	ThermoFisher	AM1975
플라스틱 스프레더(L자형 스프레더)	Fisher Scientific	14-665-231	감염된 동물의 샘플에 대한 무균 테스트에만 필요
Necropsy knifes	Livestock Concepts	WI-0009209