Microbiomechanical система для изучения формирования варикозной болезни и восстановления в Центральный нейрон аксоны
Summary
Этот протокол описывает физиологически актуальной, давлением жидкости подход для быстрого и обратимым индукции варикоз в нейронах.
Abstract
Аксональное варикоз являются расширенной структуры вдоль валов аксоны с высокой степенью неоднородности. Они присутствуют не только мозги с нейродегенеративных заболеваний или травм, но и в нормальных мозга. Здесь мы описываем микромеханические недавно созданной системы быстро, надежно и обратимо побудить аксональное варикоз, позволяет нам понять механизмы, регулирующие варикозной болезни формирования и состав гетерогенных белков. Эта система представляет собой Роман средство для оценки воздействия сжатия и сдвига стресс на различных внутриклеточных отсеков нейронов, отличается от других в vitro систем, которые в основном сосредоточены на эффект растяжения. Важно отметить, что из-за особенностей нашей системы, мы недавно сделал Роман Открытие показаны, что применение давлением жидкости может быстро и обратимо побудить аксональное варикоз через активацию Переходный рецепторный потенциал канала. Наша биомеханические системы могут быть использованы удобно в сочетании с наркотиками перфузии, живых клеток, кальция изображений и запись зажим патч. Таким образом этот метод может быть принят для изучения mechanosensitive ионные каналы, аксональное транспортного регулирования, динамика аксональное цитоскелета, кальция сигнализации и морфологические изменения связанные с травматического мозговой травмы.
Introduction
Формирование варикозной болезни, или припухлость/бисером, вдоль аксонов, является характерной особенностью нейродегенеративные, наблюдается во многих расстройств или травм центральной нервной системы, включая рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и травматические мозг травмы1,2. Несмотря на значительные физиологические последствия аксональное варикоз на распространение потенциал действия и синаптической передачи3как создаются варикоз остается неизвестным. Недавно с помощью недавно созданной microbiomechanical пробирного на искусственный Нейроны гиппокампа от грызунов, мы обнаружили, что механические раздражители могут вызвать варикоз в эти нейроны с весьма интригующим возможности. Во-первых, быстрой индукции варикозной болезни (< 10 s) и этот процесс неожиданно обратимым. Во-вторых, инициирования, варикозной болезни зависит от прочности пыхтя давление: чем выше давление, тем быстрее возбуждение. В-третьих инициирования, варикозной болезни зависит от возраста нейронов. Аксоны нейронов младший появляются более отзывчивым к механическим воздействиям, по сравнению с теми из старых нейронов. В-четвертых варикоз форме вдоль аксоны нейронов гиппокампа, а дендриты и первоначальный аксона сегменты этих нейронов отображения без изменений при том же условии уханье. Таким образом наши исследования показали новшеством нейрональных полярности. Эти выводы с системой в vitro физиологически важны. Использование модели в естественных условиях для легкой черепно-мозговой травмы (mTBI), мы показали, что аксональное варикоз разработана в нескольких координационных моды в соматосенсорной коры мышей сразу же после закрытия череп воздействия, в соответствии с нашими в пробирке результаты4. Важно отметить, что наши окрашивание и изображений mTBI мышей обеспечивают только снимок нейрональных морфологических изменений, поскольку в естественных условиях покадровой изображений в ходе механического воздействия нейрональных морфологии является до сих пор не представляется возможным.
Эта жидкость пыхтя система позволила нам не только захватить уникальные особенности, связанные с формированием механические стресс индуцированного варикозной болезни, но и для определения базового механизма. Тестируя различные внеклеточного решения, открывалки разных кандидатов mechanosensitive ионных каналов, и клеточной электрофизиологии и блокаторов, мы определили, что Переходный рецепторный потенциал катионного канала член subfamily V 4 (TRPV4) канал, который является проницаемой для Ca2 + и Na+ и активированную пыхтя отвечает главным образом за выявления первоначальных механического напряжения во время формирования аксональное варикозной болезни4. Это также было подтверждено с подходом нокаут siRNA. Взятые вместе, эта новая система пробирного, который мы разработали с культурой гиппокампа нейрон, является весьма ценной для изучения свойств микромеханические Центральной нейронов, особенно в сочетании с другими методами.
Эта система микромеханические, которую мы создали уникальна и отличается от ранее существующих систем в некоторых основных аспектах. Во-первых в этой системе, нейроны опыт вне плоскости механических напряжений в формах сжатия и сдвига. В ходе механического воздействия нейрональные процессы остаются прикрепленными к coverslip поверхности и не двигаться. Это отличается от других экспериментальных систем, предусматривающих главным образом изгиба и растяжения в плоскости (или напряжения), например, прогиб комплекте аксоны как строки5,6 перемещение или растягивание аксонов, выращенных на micropatterned каналы и растягивающийся мембраны7,8. Кроме того хотя аксональное варикоз может также быть наведено в эти анализы как в нашей системе жидкость пыхтя, процесс в этих параметров занимает гораздо больше времени (от 10 мин до нескольких часов6,,7–8) и появляется необратимый характер. Наконец, наша система, с помощью местных жидкости пыхтя позволяет изучение пространственных особенностей формирования варикозной болезни (например., дендриты, дендритных шипиков, сома, аксональное первоначальный сегментов, аксональное терминалы), кроме его временных характеристик. Используя эту систему, мы обнаружили несколько неожиданных и уникальные особенности формирования аксональное варикозной болезни, особенно быстрое наступление, медленно обратимости и аксон дендритов полярности.
Системы, которые мы обсуждаем в этом документе совместим с много методов молекулярной и клеточной биологии. Например для изучения воздействия механических напряжений на нейрональные морфологии и функции, он может использоваться вместе с coculture миелина, покадровой, Визуализация передачи энергии флуоресцентный резонанс (ЛАДА) и флуоресценции полного внутреннего отражения (TIRF), кальция изображений и патч зажим запись. В этой статье мы сосредоточены на основные компоненты системы. Гиппокампа нейрон культуры, пыхтя жидкости установки, с высоким разрешением покадровой съемки для аксональное транспорта и кальция изображений проиллюстрированы ниже шаг за шагом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот assay microbiomechanical процедура прямо вперед. Он будет производить надежные результаты, если все его шаги осуществляются тщательно. Есть несколько ключевых шагов, которые, если выполняется неправильно, будет препятствовать успешной данных коллекции. Важнейшие шаги начинают вверх по тече?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Все эксперименты на животных были проведены национальные институты здравоохранения животных использования руководящим принципам. Эта работа частично поддержали грантов от национальных институтов здравоохранения (R01NS093073 и R21AA024873) C. ГУ.
Materials
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
References
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat. Med. 17, 495-499 (2011).
- Yang, J., et al. Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin. Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nat. Rev. Neurosci. 5, 304-316 (2004).
- Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation. J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).
- Chung, R. S., et al. Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy. J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).
- Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury. Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).
- Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury. Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).
- Donkin, J. J., Vink, R. Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments. Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis. J. Micromech. Microeng. 23, 015002 (2013).
- Lu, Y. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
- Franze, K., et al. Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact. Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
