כאן, אנו מציגים כימות לא משוחדת של חלבון ספציפי לאתר acetylation ו/או succinylation תפוסה (סטויכיומטריה) של פרוטאום כולו באמצעות ניתוח רציומטרי של שינויים אנדוגני שינויים שהוכנסו לאחר כמותיים acylation כימי באמצעות anhydrides התווית על-ידי איזוטופ יציב. בשילוב עם ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים רגישים, מתקבלים באתר מדויק תפוסת מדידות.
שינוי post-translational (PTM) של שאריות ליזין חלבון מאתƐN – acylation גורם לשינויים מבניים באופן דינמי יכול לווסת פונקציות חלבון, לדוגמה, על-ידי שינוי פעילות אנזימטי או על-ידי מתווכים אינטראקציות. כימות מדויק של חלבון ספציפי לאתר acylation תפוסה, או סטויכיומטריה, חיוני להבנת ההשלכות פונקציונלי של הכללית סטויכיומטריה ברמה נמוכה והן סטויכיומטריה בודדים acylation ברמה גבוהה של ליזין ספציפי שאריות. קבוצות אחרות דיווחו על מדידה של ליזין acetylation סטויכיומטריה על-ידי השוואת היחס של פפטיד קודמן איזוטופים של שפע אנדוגני, טבעי acylation והציג אקסוגני, כבד התווית על-ידי איזוטופ acylation לאחר כמותיים acetylation כימית של חלבונים באמצעות יציבה התווית על-ידי איזוטופ אצטי. פרוטוקול זה מתאר גישה ממוטבת מציע מספר שיפורים, לרבות: (1) עלה acylation כימיות יעילות, (2) את היכולת למדוד חלבון succinylation בנוסף acetylation, (3) שיפור דיוק כמותיים תופיפצה הפרעות מופחתת באמצעות שבר כימות יון של הנתונים שאינו תלוי רכישות (DIA) במקום קודמן יון האיתות נתונים תלויי רכישה (DDA). השימוש של יונים שבר שיא שחולצו אזורים על כימות גם באופן ייחודי מאפשר בידול של acylation ברמת האתר סטויכיומטריה מ הפרוטאוליטי פפטידים המכילים אחד או יותר משקע ליזין, אשר אינה אפשרית באמצעות יון קודמן אותות על כימות. ויזואליזציה של נתונים בקו רקיע, סביבה פרוטאומיקס כמותיים קוד פתוח, מאפשר בדיקת הנתונים נוח וסקירה. יחד, זרימת עבודה זו מציעה כימות לא משוחדת, ומדויקת של ליזין בייעודי לאתר acetylation ו- succinylation אכלוסם של פרוטאום כולו, אשר עשויים לחשוף, לתעדף אתרי acylation רלוונטי מבחינה ביולוגית.
NƐ– acylation של שאריות ליזין חלבון הוא הרגולטור חשוב של פונקציה של חלבונים. ליזין acetylation ו acylations אחרים, כגון succinylation, malonylation, glutarylation, נחשבים לווסת את חילוף החומרים, התא איתות ואחרים תהליכים תאיים1,2,3,4 , יש השלכות הפרעות מטבוליות5. מחקרים רבים מצאו כי שינויים ליפיד ליזין עוברות קיפול-שינויים גדולים בתנאים שונים ברקמות יונקים וסלולרי קווים5,6,7,8 וכן חיידקים9,10,11, עם זאת, שינויים אלה קיפול יחסית אינם מספקים תובנות שחלקן של החלבון הכולל שונה. מחקרים דיווח מדידות של תפוסת באתר acylation נדיר12,13,14, למרות הרלוונטיות וזקוקים ללימודים כאלה כפי שהם מספקים יותר פרטים מאשר קיפול יחסית לשנות. לדוגמה, שינוי 10-fold יכול להציג עלייה תפוסה של האתר מ 0.01 0.1%, 1 עד 10% או אפילו 10 ל- 100%. מדידות מדויקות סטויכיומטריה נדרשים כדי לפרש את המשמעות הביולוגית של acylation וכדי לחזות השפעה לגבי ההשלכות של חלבונים מבניים, וייתכן, לשינויים פונקציונליים.
שיטה קודמת אחת לכמת תפוסת האתר מנצל כבד איזוטופ יציב כימית תיוג של שאריות ליזין יאומתו ואחריו ספקטרומטר מסה כדי למדוד את היחס בין acetylation “אור” אנדוגני בהשוואה אקסוגני, מבחינה כימית שכותרתו “כבדה” אצטיל-ליזין באמצעות קודמן יון עוצמות12. עוד מחקר שנערך על ידי ג’ואו ואח. 13 תיאר בגישה דומה כדי להעריך ליזין acetylation סטויכיומטריה גם מועסק acetylation כימי מלא של כל שאריות ליזין יאומתו בחלבונים עם איזוטופ יציב תיוג, אך שימוש בעוצמות יון פרגמנט, כפי שהיא נמדדת DDA. Nakayasu et al. 14 להשתמש בגישה DDA דומה, אך במקום זה משמש את היחס שבין קל וכבד אצטיל-ליזין immonium יונים כמת. כימות בהתבסס על פרגמנט יונים, immonium או רצף יונים (MS2), בברוב המקרים תוצאות פחות הפרעות האות לעומת עיבוד פפטיד שלם קודמן יונים (MS1). עם זאת, כימות של יונים קטע מן הספקטרום שנוצר על-ידי DDA MS/MS יכול לסבול ליקויים דגימה סטוכסטי, איפה היונים גבוהה-שפע קודמן הם נוטים יותר להיות נבחרת עבור MS/MS, לפיכך, להוביל דגימה מוטה ולא שלמים של קודמן יונים.
הרומן של זרימת עבודה זו4 (איור 1) משתמש מושגית איזוטופ יציב כימית תיוג הגישה פותח במקור על ידי Baeza ואח. 12, אולם זרימת העבודה לאחר מכן זה משולב עם דיה כדי לאסוף שני קודמן ו מרובים abundances יון פרגמנט מעל המסה לזיהוי טווח15,16 מתן חישובים סטויכיומטריה מדויק.
שיא של אזורים קטע יונים המכילים האתר acylation של עניין, או “המבדילים פרגמנט יונים”, משמשים כדי לכמת את תפוסת באתר acylation (איור 2). יונים פרגמנט שאינן מכילות את השינוי יש ערכים זהים קל וכבד מ/z, משמשים לזיהוי פפטיד, אבל לא על כימות. קו הרקיע של התוכנה17 משמש כדי לחלץ קודמן שבר שיא אזורי. הנוכחות של מספר יונים רסיס המכיל את אתר acylation נתון מספק גמישות אם הפרעות מזוהות בחלק מן היונים פרגמנט. ויזואליזציה של נתונים ב- Skyline מאפשר פיקוח קריטיות של אור עד מסיבי פרגמנט יון יחסי. בנוסף ניתוח נתונים ידנית, חבילת R פתוח נכתב באתר, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), פותחה, אשר משתמשת קודמן יון, פרגמנט יון הנתונים שנאספים באמצעות למישור הארץ מהמים, מכמת סטויכיומטריה acylation בייעודי לאתר של פפטידים המכילים שאריות ליזין מרובים, תכונה בלתי אפשרית עם מדידות יון בלבד בעוצמה קודמן4.
פרוטוקול זה גם מדגים את השימוש endoproteinase Glu-C, שהוא ספציפי למחשוף C-מסוף-שאריות גלוטמית וחומצה אספרטית, במקום להשתמש טריפסין או פרוטאז Arg-C, שהאחרון לעיתים קרובות ליצור גדולים מאוד, פוטנציאל להכפיל פפטידים הפרוטאוליטי acylated הנובע חסם טריפסין מחשוף-שאריות ליזין acylated. החומר הכימי תיוג הליך הורחב גם לכלול שימוש סוקסינית אנהידריד (איור 1), ובעקבותיו כימות של succinylation סטויכיומטריה succinylation. בנוסף שיפורים הכנת הדוגמא, המימוש של פפטיד fractionation על ידי חומציות בסיסיות מנותק, הפוך-פאזי (bRP) ההפרדה של פפטידים נוסף ירד הפרעות כמת, ומאפשר יותר דה-קונבולוציה של סטויכיומטריה acylation פרוטאום כל הדגימות. יחד, שיטה זו כולל, מדגיש מספר יתרונות: יעילות מוגברת (1) acylation כימי; (2) מדידה של חלבון סטויכיומטריה succinylation בנוסף acetylation; . ודיוק כימות משופרת (3) כימות משופרת היא בשל הפרעות ירד בפרגמנט יון אותות DIA לעומת אות מבשר DDA, כמו גם היישום של fractionation קדם פפטיד במצב לא מקוון על-ידי bRP.
פרוטוקול זה מספק של הרומן, שיטה מדויקת לכמת ליזין בייעודי לאתר acetylation ותפוסה succinylation כי ניתן להחיל על פרוטאום כולו. שיטה זו מבוססת על מדידה של פפטידים אור אנדוגני, פפטידים כבד אקסוגני, האחרונים שבהם הם שנוצר במבחנה באמצעות acylation כימית כמותית של חלבונים עם אנהידריד אצטית deuterated –d6 או סוקסינית אנהידרידד4 (איור 1). שיטות דומות יש בשימוש תיוג איזוטרופי יציב של ליזין יאומתו יליד שאריות וביצע כימות תפוסת אתר המבוסס על גם קודמן יון בלבד12 או שבר יונים מ DDA רכישות13,14. פרוטוקול זה חל על מספר שלבים במהלך הכנת הדוגמא כדי לשפר את יעילות acylation ומרחיב תיוג כימי כדי succinylation. איסוף נתונים באמצעות רכישות DIA משיג קודמן יון והן MS2 פרגמנט יון עוצמות מעל לזיהוי מסה הטווח כולו, ובכך להקטין את הפרעות יון פרגמנט. ניתוח כימות באמצעות קו הרקיע וקבצי script מותאמים אישית שפותחו מאפשרות חישוב התפוסה באתר עבור פפטידים המכילים שאריות ליזין אחד או יותר, acylation יותר מפעם אחת באתר אחד.
ישנם מספר שלבים קריטיים בשלב הכנת המדגם של פרוטוקול זה שיש אחריו מקרוב. מאחר פרוטוקול כולו מסתמך על שינוי כימי יעיל של כל שאריות ליזין, שלב זה הוא בעל חשיבות עליונה. Anhydrides מגיבים עם אמינים חינם, כך אמין המכילים מולקולות מאגר או מזהם חלבון lysate יש להמנע ממנו. גם במהלך השלב כימיים acylation, ודא כי ה-pH של תערובת התגובה מותאם בחזרה pH 8 לאחר כל אחד incubations שלושה עם אנהידריד מגיב כפי כזאתי acidifies את התערובת, ריאקציות צדדיות של O-acylation עלולה להיווצר. יתר על כן, דילול תערובת שמונה מ’ המכילות אוריאה התגובה כדי סביב אוריאה 0.8 מ’ לפני לעיכול, בדיקת רמת ה-pH הוא בתוך הטווח האופטימלי חשוב לפעילות אופטימלית של endoproteinase Glu-סי עוד מרכיב המפתח של פרוטוקול שלנו הוא השלב אוסף נתונים המבוא של זרימת עבודה למישור הארץ מהמים, אשר מתגבר על כל חוסר עקביות נתונים דגימה DDA ומאפשר אשר על כימות ברמת יון פרגמנט MS2. אחד היתרונות העיקריים של המתודולוגיה DIA היא הירידה של הפרעות אשר הם בדרך כלל הרבה יותר נוטה ובעייתי כאשר לכימות האות יון קודמן MS1 (כמו חלק מן הפרסומים הקודם הראו).
ניתן לבצע מספר שינויים בזרימת עבודה בעת הכנת דוגמאות מורכבות מאוד. מספר שברים איחדו לאחר הניתנות להפחתה של basic-pH הפוך-פאזי HPLC fractionation מנותק כדי להפחית את המורכבות של הדגימות במאגר זה לרכוש על ידי LC/גב בנוסף, עוד כרומטוגרפי מעברי צבע יכול גם לשמש במהלך רכישת כדי לאפשר הפרדה פפטיד טוב יותר. לחלופין, ניתן להשתמש פרוטאזות מרובים לעכל את דגימות לייצר מגוון גדול יותר של פפטידים cleaved ולהגדיל את הסיקור של שאריות ליזין חלבון. . האקסאלסיור ואופטימיזציה יכול להתבצע באמצעות BSA מסחרי המכיל באחוזים מסוימים של acetylation או succinylation.
מגבלה אחת על פרוטוקול זה היא אתר פוטנציאלי קלה מופרזת תפוסת בשל נרשמה שינויים ליזין אחרים, כגון מתילציה או ubiquitination, וכדומה, באותו אתר4. מחושב מאזורי שיא של ליפיד קל וכבד שינויים, L/(L+H), והתפוסה באתר זה מבוסס על ההנחה כי הרמה הכוללת של השינוי באתר ליזין מורכב acylation ‘אור’ רק אנדוגני (L) ומתויגים כימית ‘כבדים’ acylation (H). עם זאת, והתפוסה acylation הכולל בפועל האתר ויוו עשויים לכלול שינויים אחרים מעבר acetylation ו/או succinylation. בנוסף, את טוהר איזוטרופי המדווחת של ריאגנטים שנרכשו אנהידריד אצטית –d6 (99%) ואת סוקסינית אנהידריד –d4 (> 98%) עשוי לתרום מופרזת קטן של עד 2% (succinyl) או 1% (אצטיל) acylation אנדוגני רמה4. יחד, אלה overestimations קלה להוסיף הקושי לכימות אתרים עם פחות מ 1% תפוסה. שפע גדול ההבדלים בין להשלים כימית acylated פפטידים של פפטידים acylated מקורי גם לתרום האתר תפוסת כימות שגיאות פוטנציאליות, במיוחד עבור acylated אנדוגני נמוך פפטידים27. מחקר שנערך לאחרונה על ידי Weinert et al. 27 מצא כי ירידה שפע ההבדלים בין פפטידים מלאה לכל acetylated יכול להפחית את השגיאה של כימות27.
Quantifications סטויכיומטריה שנאספו באמצעות פרוטוקול זה יכול לאתר נקודות חמות acylation חשוב ב השערות חלבון ו טופס מסוים לניסויים להמשך טיפול ביולוגי, כגון מוטגנזה של אתרים מסוימים של עניין. פרוטוקול זה גם יכול לחשוף בשילוב השפעות acylation נמוך סטויכיומטריה אתרי יכול להפעיל השפעות עקיפות או עדין על יציבות מבנית חלבון מקומי סביבות הסלולר. בנוסף, יישום של פרוטוקול זה כדי למדוד את acetylation ואת succinylation ושינויים אחרים אפשריים ליזין acylation מעבר acetylation באופן ייחודי מציע תובנות ההשפעות acylation דינמי על חלבונים תחת שונות התנאים הביולוגיים.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכון NIH הלאומית של הסוכרת, העיכול, מחלות כליות NIH-NIDDK תמלא R24 DK085610 (PI: אי Verdin). JGM נתמך על ידי מלגת NIH T32 (T32 AG000266, PI: ג’יי Campisi). המחברים לאשר תמיכה של NIH משותפים גרנט אינסטרומנטציה עבור מערכת TripleTOF 6600 במכון באק (1S10 OD016281, PI: B.W. גיבסון).
aqueous acetic anhydride-d6 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 175641-1G | 1% isotopic purity |
succinic anhydride-d4 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 293741 | 2% isotopic purity |
sequencing grade endoproteinase Glu-C | Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) | 10791156001 | 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt) |
Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT 094225 | |
HPLC acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH015-4 | |
HPLC grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH365-4 | |
iodoacetamide | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
FLUKA formic acid (FA) for mass spec | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | C988C27 | ~98% |
urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
bovine serum albumin (BSA) | Pierce, Rockford, IL, USA | 88341 | |
triethylammonium bicarbonate (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408-100ML | |
anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | 43998 | |
sodium hydroxide (NaOH) | EMDMillipore, Burlington, MA, USA | SX0590 | |
50% hydroxylamine solution in water | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 438227-50ML | |
LC-MS grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC365-4 | |
LC-MS acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC015-4 | |
Eppendorf Themomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 | |
Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer | Labconco, Kansas City MO, USA | 7751000 | |
indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | model# 845 | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 |