כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים

Summary

כאן, אנו מציגים כימות לא משוחדת של חלבון ספציפי לאתר acetylation ו/או succinylation תפוסה (סטויכיומטריה) של פרוטאום כולו באמצעות ניתוח רציומטרי של שינויים אנדוגני שינויים שהוכנסו לאחר כמותיים acylation כימי באמצעות anhydrides התווית על-ידי איזוטופ יציב. בשילוב עם ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים רגישים, מתקבלים באתר מדויק תפוסת מדידות.

Abstract

שינוי post-translational (PTM) של שאריות ליזין חלבון מאת_ƐN – acylation גורם לשינויים מבניים באופן דינמי יכול לווסת פונקציות חלבון, לדוגמה, על-ידי שינוי פעילות אנזימטי או על-ידי מתווכים אינטראקציות. כימות מדויק של חלבון ספציפי לאתר acylation תפוסה, או סטויכיומטריה, חיוני להבנת ההשלכות פונקציונלי של הכללית סטויכיומטריה ברמה נמוכה והן סטויכיומטריה בודדים acylation ברמה גבוהה של ליזין ספציפי שאריות. קבוצות אחרות דיווחו על מדידה של ליזין acetylation סטויכיומטריה על-ידי השוואת היחס של פפטיד קודמן איזוטופים של שפע אנדוגני, טבעי acylation והציג אקסוגני, כבד התווית על-ידי איזוטופ acylation לאחר כמותיים acetylation כימית של חלבונים באמצעות יציבה התווית על-ידי איזוטופ אצטי. פרוטוקול זה מתאר גישה ממוטבת מציע מספר שיפורים, לרבות: (1) עלה acylation כימיות יעילות, (2) את היכולת למדוד חלבון succinylation בנוסף acetylation, (3) שיפור דיוק כמותיים תופיפצה הפרעות מופחתת באמצעות שבר כימות יון של הנתונים שאינו תלוי רכישות (DIA) במקום קודמן יון האיתות נתונים תלויי רכישה (DDA). השימוש של יונים שבר שיא שחולצו אזורים על כימות גם באופן ייחודי מאפשר בידול של acylation ברמת האתר סטויכיומטריה מ הפרוטאוליטי פפטידים המכילים אחד או יותר משקע ליזין, אשר אינה אפשרית באמצעות יון קודמן אותות על כימות. ויזואליזציה של נתונים בקו רקיע, סביבה פרוטאומיקס כמותיים קוד פתוח, מאפשר בדיקת הנתונים נוח וסקירה. יחד, זרימת עבודה זו מציעה כימות לא משוחדת, ומדויקת של ליזין בייעודי לאתר acetylation ו- succinylation אכלוסם של פרוטאום כולו, אשר עשויים לחשוף, לתעדף אתרי acylation רלוונטי מבחינה ביולוגית.

Introduction

N_Ɛ– acylation של שאריות ליזין חלבון הוא הרגולטור חשוב של פונקציה של חלבונים. ליזין acetylation ו acylations אחרים, כגון succinylation, malonylation, glutarylation, נחשבים לווסת את חילוף החומרים, התא איתות ואחרים תהליכים תאיים^1,2,3,4 , יש השלכות הפרעות מטבוליות⁵. מחקרים רבים מצאו כי שינויים ליפיד ליזין עוברות קיפול-שינויים גדולים בתנאים שונים ברקמות יונקים וסלולרי קווים^5,6,7,8 וכן חיידקים^9,10,11, עם זאת, שינויים אלה קיפול יחסית אינם מספקים תובנות שחלקן של החלבון הכולל שונה. מחקרים דיווח מדידות של תפוסת באתר acylation נדיר^12,13,14, למרות הרלוונטיות וזקוקים ללימודים כאלה כפי שהם מספקים יותר פרטים מאשר קיפול יחסית לשנות. לדוגמה, שינוי 10-fold יכול להציג עלייה תפוסה של האתר מ 0.01 0.1%, 1 עד 10% או אפילו 10 ל- 100%. מדידות מדויקות סטויכיומטריה נדרשים כדי לפרש את המשמעות הביולוגית של acylation וכדי לחזות השפעה לגבי ההשלכות של חלבונים מבניים, וייתכן, לשינויים פונקציונליים.

שיטה קודמת אחת לכמת תפוסת האתר מנצל כבד איזוטופ יציב כימית תיוג של שאריות ליזין יאומתו ואחריו ספקטרומטר מסה כדי למדוד את היחס בין acetylation “אור” אנדוגני בהשוואה אקסוגני, מבחינה כימית שכותרתו “כבדה” אצטיל-ליזין באמצעות קודמן יון עוצמות¹². עוד מחקר שנערך על ידי ג’ואו ואח. ¹³ תיאר בגישה דומה כדי להעריך ליזין acetylation סטויכיומטריה גם מועסק acetylation כימי מלא של כל שאריות ליזין יאומתו בחלבונים עם איזוטופ יציב תיוג, אך שימוש בעוצמות יון פרגמנט, כפי שהיא נמדדת DDA. Nakayasu et al. ¹⁴ להשתמש בגישה DDA דומה, אך במקום זה משמש את היחס שבין קל וכבד אצטיל-ליזין immonium יונים כמת. כימות בהתבסס על פרגמנט יונים, immonium או רצף יונים (MS2), בברוב המקרים תוצאות פחות הפרעות האות לעומת עיבוד פפטיד שלם קודמן יונים (MS1). עם זאת, כימות של יונים קטע מן הספקטרום שנוצר על-ידי DDA MS/MS יכול לסבול ליקויים דגימה סטוכסטי, איפה היונים גבוהה-שפע קודמן הם נוטים יותר להיות נבחרת עבור MS/MS, לפיכך, להוביל דגימה מוטה ולא שלמים של קודמן יונים.

הרומן של זרימת עבודה זו⁴ (איור 1) משתמש מושגית איזוטופ יציב כימית תיוג הגישה פותח במקור על ידי Baeza ואח. ¹², אולם זרימת העבודה לאחר מכן זה משולב עם דיה כדי לאסוף שני קודמן ו מרובים abundances יון פרגמנט מעל המסה לזיהוי טווח^15,16 מתן חישובים סטויכיומטריה מדויק.

שיא של אזורים קטע יונים המכילים האתר acylation של עניין, או “המבדילים פרגמנט יונים”, משמשים כדי לכמת את תפוסת באתר acylation (איור 2). יונים פרגמנט שאינן מכילות את השינוי יש ערכים זהים קל וכבד מ/z, משמשים לזיהוי פפטיד, אבל לא על כימות. קו הרקיע של התוכנה¹⁷ משמש כדי לחלץ קודמן שבר שיא אזורי. הנוכחות של מספר יונים רסיס המכיל את אתר acylation נתון מספק גמישות אם הפרעות מזוהות בחלק מן היונים פרגמנט. ויזואליזציה של נתונים ב- Skyline מאפשר פיקוח קריטיות של אור עד מסיבי פרגמנט יון יחסי. בנוסף ניתוח נתונים ידנית, חבילת R פתוח נכתב באתר, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), פותחה, אשר משתמשת קודמן יון, פרגמנט יון הנתונים שנאספים באמצעות למישור הארץ מהמים, מכמת סטויכיומטריה acylation בייעודי לאתר של פפטידים המכילים שאריות ליזין מרובים, תכונה בלתי אפשרית עם מדידות יון בלבד בעוצמה קודמן⁴.

פרוטוקול זה גם מדגים את השימוש endoproteinase Glu-C, שהוא ספציפי למחשוף C-מסוף-שאריות גלוטמית וחומצה אספרטית, במקום להשתמש טריפסין או פרוטאז Arg-C, שהאחרון לעיתים קרובות ליצור גדולים מאוד, פוטנציאל להכפיל פפטידים הפרוטאוליטי acylated הנובע חסם טריפסין מחשוף-שאריות ליזין acylated. החומר הכימי תיוג הליך הורחב גם לכלול שימוש סוקסינית אנהידריד (איור 1), ובעקבותיו כימות של succinylation סטויכיומטריה succinylation. בנוסף שיפורים הכנת הדוגמא, המימוש של פפטיד fractionation על ידי חומציות בסיסיות מנותק, הפוך-פאזי (bRP) ההפרדה של פפטידים נוסף ירד הפרעות כמת, ומאפשר יותר דה-קונבולוציה של סטויכיומטריה acylation פרוטאום כל הדגימות. יחד, שיטה זו כולל, מדגיש מספר יתרונות: יעילות מוגברת (1) acylation כימי; (2) מדידה של חלבון סטויכיומטריה succinylation בנוסף acetylation; . ודיוק כימות משופרת (3) כימות משופרת היא בשל הפרעות ירד בפרגמנט יון אותות DIA לעומת אות מבשר DDA, כמו גם היישום של fractionation קדם פפטיד במצב לא מקוון על-ידי bRP.

Protocol

1. באופן כמותי Acetylate ו/או חלבונים Succinylate באמצעות התווית על-ידי איזוטופ אצטית או אנהידריד סוקסינית להכין 3 ושכפול של 100 µg מדגם החלבון אלבומין שור (BSA) במקביל, על ריכוז של µg 1/µL (סך של 100 µL), באמצעות פתרון ביקרבונט (TEAB) של אוריאה ו triethylammonium (אוריאה 8 מ’, 200 מ”מ TEAB, pH 8).הערה: חשוב להשתמש אמין ללא מאגר. הדגימות חלבון המשמש כאן במקטע תוצאות נציג BSA, באופן כמותי-BSA, succinylated, תערובות הימנו מניב BSA דגימות עם שהוגדרו succinylation תפוסה-0%, 1%, 10%, 50% ו- 100%, בהתאמה (כל מדגם תהיה מוכנה ב 3 משכפל). פרוטוקול זה גם בוצעה באמצעות חלבון lysates מ- Escherichia coli ועכבר כבד4. הפרוטוקול ניתן גם ליישם lysates תאים או רקמות אחרות. להפחית 100 µL מדגם BSA (100 µg) עם 8 µL של 250 מ מ dithiothreitol (DTT) כדי להגיע ריכוז סופי של 20 מ מ DTT, דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם עצבנות-1400 סל ד. Alkylate המדגם BSA מופחתת עם 21.6 µL של 200 מ מ iodoacetamide כדי להגיע ריכוז סופי של 40 מ מ iodoacetamide, דגירה המדגם בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.הערה: חשוב לקיים את הריכוז iodoacetamide מעט יותר מ 2 x ריכוז DTT כדי לוודא כי מופחת כל חלבון תיולים הם alkylated. להמשיך עם הכנת אנהידריד אצטית -d6 (שלב 1.4.1) או סוקסינית אנהידרידד4 (שלב 1.4.2) נחוצות עבור acetylation (כמותית) כימי או succinylation של הדגימות. לקבוע את molarity (ז) של aliquot 1 gd6 פתרון אנהידריד אצטית מימית – משקל מולקולרי (108.13 g/mol), צפיפות (1.143 g/mL 25 ° c).הערה: החבילה 1 g מכילה µmol 9,248 אצטית אנהידרידברה6 בנפח µL 875, מניב פתרון מ’ 10.57 משמש לכל acetylation של הדגימות. להכין פתרון 5 מ’ של סוקסינית אנהידריד -d4 על ידי המסת האבקה של דימתיל סולפוקסיד נטול מים מייד לפני התגובה כדי להימנע הידרוליזה מהתרכובת. להמיס 0.24 גר’ סוקסינית אנהידריד -d4 ב µL 461 של דימתיל סולפוקסיד נטול מים כדי להשיג פתרון 5 מ’. לבצע acetylation כימית כמותית או succinylation על-ידי הוספת µmol 60 אנהידריד אצטית -d6 (6 µL של הפתרון 10.57 מ’) או סוקסינית אנהידריד -d4 (12 µL של הפתרון 5 מ’) בהתאמה, דגירה לדוגמה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות על מערבל מערבולת.הערה: בגלל החומציות של anhydrides, חלבונים עשויה לזרז. שימו לב ולהתאים כפי שמתואר בשלב 1.6. להוסיף 10 µL של 7.25 מ’ NaOH לאחר הדגירה כדי להגדיל את רמת ה-pH 8 ~ לחסל את כל הצד O-acylation-מוצרים. מערבולת בקצרה, בדיקת pH לדוגמה על ידי סיכוייכם µL 1 על נייר pH.הערה: יתכן צורך להוסיף µL יותר מ- 10 של NaOH 7.25 מ’ כדי להגיע pH 8. בנוסף, פוטנציאל זירז חלבונים, צריך לפזר מחדש. חזור על כל-acylation ו- pH לכוונון השלבים 1.5 ו 1.6 עבור סכום כולל של שלוש פעמים. בדוק את ערכי ה-pH ורשום את עוצמת הקול של יסוד פתרון נוסף לכל רפטיציה. עבודה במהלך בזריזות לעיל acylation כימי צעדים מכיוון anhydrides hydrolyze ולאבד את תגובתיות. לאחר גמר תיוג התגובה ו- pH ההתאמה, להוסיף 10 µL של 50% פתרון hydroxylamine לחזור ריאקציות צדדיות O-acylation. 2. תקציר הגיבו דגימות חלבון באמצעות Glu-C Endoproteinase לדלל את ריכוז אוריאה 0.8 מ’ באמצעות 50 מ מ TEAB, pH 8, לנרמל את אמצעי האחסון מדגם. לעכל את דגימות חלבון על-ידי הוספת endoproteinase Glu-C ב- 1:50 פרוטאז יחס חלבון המצע (w/w) דגירה הדגימות בן לילה ב 37 ° C עם עצבנות-1400 סל ד. Acidify, להרוות את הדגימות עיכול חלבונים על-ידי הוספת חומצה פורמית 1% לפי נפח. Desalt את הדגימות באמצעות תרמילי מיצוי מוצק-שלב האיזון הידרופילית-lipophilic. להשתמש כדור אחד של sorbent 30 מ”ג לכל דוגמה, מקסימום 5 מ”ג חומר לכל מחסנית4,18.הערה: חשוב לשמור את sorbent בתוך המחסנית רטוב לאורך כל התהליך desalting הזה. בעת הצורך, כבה את משאבת ואקום כדי להאט את המעבר של הממס או דגימה באמצעות המחסנית. הכנס את מחסנית לתוך ביציאות בהן על יריעה ואקום בלוק זכוכית 24 יציאות והפעל את משאבת ואקום. השאר יציאות שאינן בשימוש כתרים. השאר יציאות אחד או שניים רצ’ט האו ם כדי לשמור על הלחץ נמוך יותר על מד ואקום במידת הצורך. רטוב בכל מחסנית פעמיים עם 800 µL של 80% acetonitrile (ACN)/0.2% formic acid/19.8% מים. להבטיח רמת הממס נשאר 2-3 מ מ מעל רמת sorbent. ודא שמד וואקום על יריעה קורא 16.9-67.7 kPa (5 – 20 ב- Hg). Equilibrate בכל מחסנית 3 פעמים עם 800 µL 0.2% חומצה פורמית במים. ודא שמד וואקום על יריעה קורא 16.9-67.7 kPa (5 – 20 ב- Hg). לטעון את הדגימות פפטיד על הדיו. ודא מד וואקום על יריעה קורא 6.77 – 8.47 kPa (2 – 2.5 ב- Hg), קצב הזרימה לא יעלה על 1 mL/min. לשטוף בכל מחסנית 3 פעמים עם 800 µL 0.2% חומצה פורמית במים. ודא שמד וואקום על יריעה קורא 16.9-67.7 kPa (5 – 20 ב- Hg). הסר את מיכל הדיו יריעה ואקום, להתקבע microtube 1.5 mL. Elute פפטידים פעם אחת עם 800 µL של 80% ACN/0.2% formic acid/19.8% מים ומאפשרים הממס דגירה עם sorbent למשך 2-3 דקות. להשתמש על פיפטה כדי לדחוף הממס דרך השכבה sorbent בתוך המחסנית. חזור על • השני תנאי של 400 µL 80% ACN/0.2% formic acid/19.8% מים לתוך microtube 1.5 mL אותו. יבש את eluate על ידי צנטריפוגה ואקום (קבוע קצב צנטריפוגה ב x 268 גרם), בדרך כלל במשך 3 שעות.הערה: אם יש צורך, דוגמאות eluate יבשים ניתן לאחסן קפוא ב-20 ° C עד מוכן להמשיך עם fractionation. 3. fractionate פפטידים באמצעות Basic-pH מנותק הפוכה שלב HPLC מחדש להשעות את כל-acylated ודוגמאות Glu-C מתעכל (להכין כפי שמתואר בסעיפים 1 ו- 2) ב- 200 µL מאגר A (10 מ מ אמוניום formate במים, pH 10), מערבבים את הדגימה למשך 10 דקות על מערבל מערבולת ב 4 ° C ו צנטריפוגה ב 17,500 x g 10 דקות בחדר טה mperature.הערה: המדגם פפטיד שנוצר הוא מוכן להיות מנותק fractionated על ידי ה-pH גבוה ההפרדה19,20. תוכנית בשיטת fractionation HPLC מנותק בהתאם כלי תוכנה בשימוש. השיטה הבאה היא ספציפית עבור מערכת בינארית HPLC משאבה כולל גלאי כפול אורך גל UV, של תעשיה, אספן שבר של עמודה סי18 (4.6 מ מ x 250 מ מ, 5 µm גודל החלקיקים) סובלנית pH 10. לאסוף 40 שברים בכל 2.1 דקות לכל סיעה ולשלב כל שבר הרביעי, וכתוצאה מכך שברים במאגר הסופי ארבעה4. מספר רב יותר של שברים במאגר יכול לשמש כדי לצמצם עוד יותר את הדגימה המורכבות על חשבון זמן אוסף נתונים ספקטרומטר מסה. מתייבשים שברים במאגר, איזה שהוא לופילייזר, מחדש להשעות את הדגימות פפטיד יבשים ב 1 מ”ל של 50% לחצן מצוקה ו 1% חומצה פורמית במים, להעביר מכולה מדגם קטן יותר. יבש את הדגימה מועברת באמצעות צנטריפוגה ואקום (קבוע קצב צנטריפוגה ב x 268 גרם), בדרך כלל עבור 1 h.הערה: לחץ אדים נמוכה של אמוניום formate עלולה להקשות יבוש מלא. אם כמות משמעותית של אמוניום formate מלח נשארים כמו מלח התמיסה לאחר ייבוש, חזור על החילוץ מעבדתי. מחדש להשעות את הדגימות ב 20 µL 0.2% חומצה פורמית במים עם השמירה אינדקס זמן (הרכבת התחתית) פפטיד תערובת סטנדרטי.הערה: דגימות. אתה מוכן לניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה. 4. דיה ניתוח דוגמאות פפטיד Fractionated לנתח את הדגימות באמצעות שיטה DIA LC-MS/MS, אשר יכול להיות מותאם על פי מסה spectrometric הכלים העומדים לרשותנו. הניתוח בוצע באמצעות ננו-LC 2D HPLC מערכת מקוון מחובר ספקטרומטר מסה זמן-של-טיסה (QqTOF) פאול אורתוגונלית. לתכנת את כלי התוכנה כך פפטיד תערובות מועברים על גבי שבב עמודה קדם סי18 (מיקרומטר 200 x 6 מ”מ סי18-CL שבב, מיקרומטר 3, 300 Å) וכביסה ב 2 µL/דקה 10 דקות עם הממס טעינה (H2O/0.1% חומצה פורמית) עבור desalting. להפריד את פפטידים chromatographically על שבב ס”מ סי18-CL מיקרומטר 75 x 15 (מיקרומטר 3, 300 Å) בספיקה של 300 nL/דקה עם מעבר צבע 2 h שימוש אופייני (וגם LC-מערכת ספציפי) מימית, לחצן מצוקה הממס אנשים רגילים4. ליצור שיטה DIA חלון משתנה, איפה החלונות טווח המונית של רוחב משתנה (5 עד 90 מ/z) מועברים מ פאול Q1 לתוך התא התנגשות בשלבים הדרגתיים על פני הטווח ההמוני מלא (מ/z 400-1,250).הערה: זמן המחזור של 3.2 s כולל סריקה יון קודמן 250 ms ואחריו 45 ms זמן הצטברות עבור כל אחד 64 אלומה מקטעי21,22. לזהות פפטידים באמצעות ניתוח מקביל של דוגמאות על-ידי DDA MS ובניית ספריות ספקטרלי, או לחלופין, ניתן לזהות פפטידים ישירות מ- DIA נתונים באמצעות PIQED תוכנה23, אשר מטפל כל השלבים הטכניים של עיבוד נתונים. זיהוי, ייבוא לתוך הרקיע על כימות עוקבות. 5. דוגמה נתונים ניתוח הדרכה הורד את התוכנה הרקיע (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) וליצור חשבון PanoramaWeb (https://panoramaweb.org).הערה: לקבלת הדרכות מפורט המתאר את השימוש הרקיע עם נתונים, עיין (https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials). אלגוריתמים תוכנה אחרים עשוי לשמש במקום לחלץ הרכישות למישור הארץ מהמים, כגון אלומה פתוח24, אלומה 2.0 תוסף לתוך PeakView25ו- Spectronaut26שבר קל וכבד יון שיא אזורים. הורד את הקובץ נתונים הרקיע עבור התוצאות נציג succinylated BSA (איור 3) פנורמה ציבורי: https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url. בדף האינטרנט פנורמה, גש לשולחן “המיועד הרצפים MS”, להוריד את הקובץ sky.zip לבחור את הקישור להורדה בצד ימין. לחלץ את התיקיה. zip שהורדת ולאחר לחיצה כפולה על הקובץ skyline.sky כדי לפתוח אותו בהרקיע. בדיקת העץ היעד יון פרגמנט (החלונית הימנית) פפטיד של chromatograms ארבעה מ מוגדר באחוזים של אור succinylation (לוחות נכון). בחר בתפריט “תצוגה”, נווט אל “הפסגה אזורים | שכפל השוואה”. לוח “שיא אזורים – לשכפל השוואה” המכיל מגרפים יופיע בצד ימין של החלון. בחלונית ‘ שיא אזורי ‘, לחצו לחיצה ימנית ובחרו ‘ מעברים | יחיד”, אשר מציג אזור הפסגה פרגמנט יון יונים קטע שנבחר. לבסוף, לחץ לחיצה ימנית על הלוח “שיא אזורים” ובחר “סדר | מסמך”. בחלונית עץ ‘ יעד ‘ בצד שמאל של החלון, לחץ לחיצה ימנית על פפטיד “E.LCKVASLRE. T | יחסי אל | Oneheavy”, המחשבת את היחס של יון אור אות על אות יון כבד, קל/כבד.הערה: זו אינה זהה לזו של האתר תפוסת סטויכיומטריה יחס של Light/(Heavy+Light). שים לב כי העץ היעד מדווח עכשיו את היחס L/H בצד ימין של היונים שבר אור. לקבוע את “בידול פרגמנט יונים” המכילים האתר acylation של עניין.הערה: כפי שמוצג באיור3, הכולל דוגמה זו מדויק, היונים המבדילים היו נחושים כמו y7 (הגבוה ביותר מדורגים), y8, b3ו- b4. שים לב כי היונים פרגמנט שאינם מבדילים מראים על יחס של 1 בעץ היעד. בעץ היעד בחלונית השמאלית, תחת 588.30 + + sub צומת של פפטיד E.LCKVASLRE. T, לחץ על עולה 7 יו ‘ המבדילים פרגמנט יוןK [y7 ] – 902.49 + (rank1) [5]שים לב את הגדלת גובה שיא ואזור. בעץ היעד בחלונית השמאלית, תחת 588.30 + + sub צומת של פפטיד E.LCKVASLRE. T, לחץ על y5 שאינם מבדילים פרגמנט יון [y5 ] – 575.31 + (דרגה 6) [1]. שים לב כי y5 פרגמנט יון chromatograms והאזורים שיא ביותר להישאר בטווח זהה עבור כל הדגימות. בחלונית עץ ‘ יעד ‘, לדפדף אחרים המבדילים (יחס שונה מ-1), שאינם מבדילים (יחס של 1) קטע יונים, להבחין שינויי דפוסי באזור פסגת בר גרף chromatograms. לקבוע את אזורי שיא המדויק עבור זוגות קל וכבד של היונים המבדילים על מנת לחשב את סטויכיומטריה (עבור פרטים נוספים ראו גם מאייר. ואח 4)-לחץ על “נוף | רשת מסמך’, רשת המסמך תופיע כעת. בחלק העליון השמאלי של רשת המסמך, לחץ על “נוף | מעבר תוצאות”לראות טבלה מרובה-עמודות עם פרגמנט יון מידע, כגון רצף פפטיד, קודמן mz, שם לשכפל, וכו ‘. לשנות את עיצוב הדוח כדי “לסובב” על-ידי לחיצה על “נוף” ברשת המסמך ובחירה “עריכת תצוגה’ כדי לפתוח את החלון התאמה אישית של תצוגה שוב. בפינה השמאלית התחתונה של החלון “התאמה אישית של תצוגה”, סמן את “ציר לשכפל את השם” ובחר “אישור” לסגור את החלון התאמה אישית של תצוגה. לצפות כי עכשיו חלון שולחן “המסמך: רשת המעבר תוצאות” ארגן מחדש לקבץ את השם לשכפל, זמן השמירה, אזור, הרקע, שיא הדרגה עמודות על-ידי לשכפל (1%, 10%, 50%, 100% succinylation). עבור פפטיד “E.LCKVASLRE. T”בטבלה”המסמך: רשת המעבר תוצאת”, למצוא את העמודה”Mz קודמן”, העמודה”שבר יון”, העמודה (1% succinylation) באזור 1pct_light_sw1. שימו לב כי ישנם שני קודמן יונים בשביל זה פפטיד, אור (Mz קודמן של 588.30 הראשון 8 שורות), וכבד (Mz קודמן של 590.32 אחרונה 8 שורות). בעמודה “שבר יון”, למצוא שתי שורות יון פרגמנט y8 התואם את האור ואת היונים קודמן כבד. מן השורות באותה העמודה אזור 1pct_light_sw1, להקליט את האזורים y8 האור (15,820), הכבד (1,426,461). באמצעות ערכים אלה באזור שיא, לחשב את סטויכיומטריה succinylation, או היחס משתנה, בהתאם לנוסחה שלהלן ולקבל יחס סטויכיומטריה של 0.01, או 1% succinylation, אשר תואם את חלקם של אור succinylation הזה מוגדר תערובת: לחשב את יחס סטויכיומטריה succinylation 10% באמצעות y8 המבדילים פרגמנט יון שיא באזור הערכים מהעמודה אזור 10pct_light_sw1, 144,953 (אור), 1,188,041 (כבד), כדי לקבל יחס של 0.10 או 10% succinylation. לחשב את יחס סטויכיומטריה succinylation 100% באמצעות y8 המבדילים פרגמנט יון שיא באזור הערכים מהעמודה אזור 100pct_light_sw1, 954,513 (אור), 16,407 (כבד), כדי לקבל יחס של 0.98 או 98% succinylation. באופן דומה, לחשב את יחס סטויכיומטריה succinylation 1% באמצעות b3 המבדילים פרגמנט יון שיא באזור הערכים מהעמודה אזור 1pct_light_sw1, 55,697 (אור), 3,149,119 (כבד), כדי לקבל יחס של 0.01, או succinylation 1%. המשך החישובים יחס סטויכיומטריה באמצעות הנוסחה עבור כל המבדילים פרגמנט היונים, יונים y ו- b, כדי להשיג succinylation ליזין סטויכיומטריה ערכי לתערובות succinylation 1, 10, 50 ו- 100%.

Representative Results

לאחר ייבוא נתונים, המבדילים MS2 פרגמנט יונים היו נחושים מ פפטידים הפרוטאוליטי acylated, שחולצו לאחר מכן יון chromatograms (XIC) עובדו הרקיע, ואת האור המתאימה, שיא כבד באזורים יוצאו שהיו סוף סוף משמש לחישוב התפוסה באתר. איור 2A מראה של רעיונית איור של איך ייתכן XIC קודמן-יון מופיעות שמציעות שתי אותות פפטיד קל וכבד, איור 2B מציג דוגמה של השבר המתאים יון XICs עם קודי הצבע (אדום = אור; כחול = כבד ) עבור המבדילים יונים רסיס המכיל את השינויים acylation ליזין. איור 3 מראה נתונים הנובעים ניסוי תפוסה, כמו שתוארו לעיל בניתוח יחסי מוגדרים מראש של אור/האבי succinylated BSA שנוצר בארגון-1, 10, 50, או 100% והקביעה של תפוסת succinylation הימנו. ייבוא נתונים תפוסת למישור הארץ מהמים אל הרקיע מאפשר הדמיה קל של העץ היעד, הצגת רצפי פפטיד, יונים קטע שני עבור היונים קודמן קל וכבד (איור 3 א). נתונים מ למישור הארץ מהמים-MS של כל יחס מוגדר succinylated BSA חשף immanently היחסי הבדלי יחס של אור עד מסיבי y7 יון, בדירוג הגבוה ביותר המבדילים פרגמנט יונים מן ההתאמה פפטיד מזוהה-ספקטרה (המצוין באדום, איור 3B). איור 4 מציג סקירה של תוצאות מעובד מהחישוב MS2 תפוסת שאישרה והתפוסה אחוזי succinylation של חלבון קלט, כאן המורכב BSA טרום-succinylated. ליזין נמדד תפוסה succinylation עבור 20 פפטידים הפרוטאוליטי succinylated המתקבל BSA טרום מסחרי-succinylated, succinylated-אחוזים מוגדרת (למשל, ב- 0, 1, 10, 50 ו- 100%) מוצגות בטבלה מס ‘ 2. עבור כל אחד של פפטידים BSA הפרוטאוליטי 20, הגבוה ביותר מדורגים, המבדילים MS2 פרגמנט יון שימש לחישוב התפוסה ליזין succinylation (Ksucc), כמו L/(L+H) %. בסך הכל, כימות מבוססי MS2 הראה דיוק טוב מאוד בקביעת acylation תפוסה בכלל stoichiometries נמוכה. איור 1: זרימת העבודה סטויכיומטריה- (א) חלבונים מודגרת שלוש פעמים עם אנהידריד אצטית -d6 כדי acetylate שאריות ליזין שלא שונתה. הבא, acetylated חלבונים מתעכלים עם endoproteinase Glu-C, ואחריו HPLC fractionation של פפטידים הפרוטאוליטי באמצעות כרומטוגרפיה הפוך-פאזי basic-pH. לבסוף, פפטידים מנותחים על-ידי LC-MS באמצעות למישור הארץ מהמים עם רוחב חלון קודמן משתנה. (B) אותה זרימת עבודה משמש כדי לקבוע סטויכיומטריה succinylation כמתואר ב- (א), חוץ acylation כבד הכימית משתנה סוקסינית אנהידריד -ד4. איור מקורי מאייר ואח. 4 (ג’יי אני מספר הביטוח הלאומי מסה Spectrom., הפתוח בחירה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2: דוגמה אפשרית נתונים שהושגו וחישובים סטויכיומטריה- (א) אור (L), כבד יונים קודמן של MS1 (H), המכיל אחת ליזין acetylated נבדלים 3 יחידות מסה. XICs נוצרים עבור מעטפות איזוטרופי קל וכבד המצוין אדום וכחול, בהתאמה. (B) כימות של MS2 יון שבר XICs של רכישות למישור הארץ מהמים יכול להתבצע באמצעות ‘להבדיל’ שבר קל וכבד יונים המכילים את האתר acetylation שצוינו אדום וכחול. יונים קטע משותף מוצגים בשחור מנוקד, מכיל האתר של השינוי. איור מקורי מאייר ואח. 4 (ג’יי אני מספר הביטוח הלאומי מסה Spectrom., הפתוח בחירה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3: קו הרקיע ויזואליזציה של פפטיד BSA הפרוטאוליטי succinylated ברמות שונות תפוסה. (א) של קו הרקיע של היעד עץ מציג את פפטיד הפרוטאוליטי LCKsuccVASLRE וכתוצאה שלה קטע יונים. (B) הרקיע חילצה פרגמנט chromatograms יון ברמות משתנות של תפוסת succinylation. מדורגת הגבוהה ביותר המבדילים יון, y7, גדל באזור שיא 1, 10, 50 ו- 100% מתאם לאחוז קלט של BSA pre-succinylated (נוצר בחברה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4: הערכת BSA סטויכיומטריה acylation של BSA טרום-succinylated. חמש דוגמאות BSA שונים-מוגדר אחוזי השינוי כבד (למשל., 0, 1, 10, 50 ו- 100%) היו נתונים MS2 תפוסה של נחישות. תפוסה של האתר עבור 20 פפטידים BSA succinylated היו נחושים מן הגבוה ביותר מדורגים המבדילים פרגמנט היונים עבור חמש דגימות BSA שונים-מוגדר אחוזי השינוי אור (למשל, ב- 0, 1, 10, 50 ו- 100%). העלילה תיבת משערה מציג את ההתפלגות של פפטידים succinyl 20 ערכים מ- 50% של פפטידים נמצאים בתיבה’ ‘ (אחוזון 25% על אחוזון 75%), משערה העליון מציינת את הערכים של אחוזון 75% לכל היותר (100%), מציין שפם התחתון הערכים של אחוזון 25% מינימום (אחוזון 0%). (ג’יי אני מספר הביטוח הלאומי מסה Spectrom., הפתוח בחירה). כימות של מדידות ניתן למצוא בטבלה מס ‘ 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. הזמן (דקות) % A % B 0.00 100 0 7.27 92 8 45.27 73 27 49.27 69 31 65.27 61 39 72.27 40 60 80.00 10 90 85.00 10 90 86.00 100 0 120.00 100 0 קצב הזרימה: 0.7 mL/min מאגר ת 10 מ מ אמוניום formate במים, pH 10 מאגר ב’: 10 מ מ אמוניום formate ב- 90% מים לחצן מצוקה ו-10%, pH 10 הערה: ה-pH של שני שלבים נייד מותאם 10 עם אמוניה מסודר טבלה 1: מעבר צבע עבור מנותק basic-pH הפוך-פאזי HPLC fractionation. אורך מעבר הצבע: 120 דקות מאגר ת 10 מ מ אמוניום formate במים, pH 10. מאגר ב’: 10 מ מ formate אמוניום ב- 90% מים לחצן מצוקה ו-10%, pH 10. L / L + H ב- % L / L + H ב- % L / L + H ב- % L / L + H ב- % L / L + H ב- % Ksucc 0% Ksucc 1% Ksucc 10% Ksucc 50% Ksucc 100% 0.2 1.7 11.1 50.9 99.2 1.2 2.3 12.3 49.4 97.6 2.9 3.8 14 48.6 99.5 0.5 1.8 11.7 50.8 99.5 0.2 1.7 11.1 48.3 98.2 0.2 1.2 11 47.5 96.1 0.3 1.6 12.8 51 99.2 3.7 5.2 14.7 51.9 89.5 1.5 1.8 12.5 47.2 91.1 0.8 1.5 11.3 48.4 96.8 0.2 1.6 13.9 49.7 98.9 0.1 1.1 10.7 48.2 98.6 0.2 0.9 10.3 49.4 99.4 0.5 2.5 17.2 52.3 97.5 0.1 3.5 20.8 51 99 0.3 1.9 10.7 49.6 98.2 2 1.7 10.9 47.7 96.3 0.3 1.2 10 53 98 1.1 1.8 12.9 57.9 94.1 0.2 1.4 11.6 48.6 98.8 בטבלה 2: כימות נמדד BSA ליזין succinylation תפוסה של פפטידים הפרוטאוליטי succinylated 20- פפטידים Succinylated המתקבל BSA טרום מסחרי-succinylated, succinylated-אחוזים מוגדרת (למשל, ב- 0, 1, 10, 50 ו- 100%). עבור כל אחד של פפטידים BSA הפרוטאוליטי 20, הגבוה ביותר מדורגים, המבדילים MS2 פרגמנט יון שימש לחישוב התפוסה ליזין succinylation (Ksucc), כמו L/(L+H) %.

Discussion

פרוטוקול זה מספק של הרומן, שיטה מדויקת לכמת ליזין בייעודי לאתר acetylation ותפוסה succinylation כי ניתן להחיל על פרוטאום כולו. שיטה זו מבוססת על מדידה של פפטידים אור אנדוגני, פפטידים כבד אקסוגני, האחרונים שבהם הם שנוצר במבחנה באמצעות acylation כימית כמותית של חלבונים עם אנהידריד אצטית deuterated –d₆ או סוקסינית אנהידרידד₄ (איור 1). שיטות דומות יש בשימוש תיוג איזוטרופי יציב של ליזין יאומתו יליד שאריות וביצע כימות תפוסת אתר המבוסס על גם קודמן יון בלבד¹² או שבר יונים מ DDA רכישות^13,14. פרוטוקול זה חל על מספר שלבים במהלך הכנת הדוגמא כדי לשפר את יעילות acylation ומרחיב תיוג כימי כדי succinylation. איסוף נתונים באמצעות רכישות DIA משיג קודמן יון והן MS2 פרגמנט יון עוצמות מעל לזיהוי מסה הטווח כולו, ובכך להקטין את הפרעות יון פרגמנט. ניתוח כימות באמצעות קו הרקיע וקבצי script מותאמים אישית שפותחו מאפשרות חישוב התפוסה באתר עבור פפטידים המכילים שאריות ליזין אחד או יותר, acylation יותר מפעם אחת באתר אחד.

ישנם מספר שלבים קריטיים בשלב הכנת המדגם של פרוטוקול זה שיש אחריו מקרוב. מאחר פרוטוקול כולו מסתמך על שינוי כימי יעיל של כל שאריות ליזין, שלב זה הוא בעל חשיבות עליונה. Anhydrides מגיבים עם אמינים חינם, כך אמין המכילים מולקולות מאגר או מזהם חלבון lysate יש להמנע ממנו. גם במהלך השלב כימיים acylation, ודא כי ה-pH של תערובת התגובה מותאם בחזרה pH 8 לאחר כל אחד incubations שלושה עם אנהידריד מגיב כפי כזאתי acidifies את התערובת, ריאקציות צדדיות של O-acylation עלולה להיווצר. יתר על כן, דילול תערובת שמונה מ’ המכילות אוריאה התגובה כדי סביב אוריאה 0.8 מ’ לפני לעיכול, בדיקת רמת ה-pH הוא בתוך הטווח האופטימלי חשוב לפעילות אופטימלית של endoproteinase Glu-סי עוד מרכיב המפתח של פרוטוקול שלנו הוא השלב אוסף נתונים המבוא של זרימת עבודה למישור הארץ מהמים, אשר מתגבר על כל חוסר עקביות נתונים דגימה DDA ומאפשר אשר על כימות ברמת יון פרגמנט MS2. אחד היתרונות העיקריים של המתודולוגיה DIA היא הירידה של הפרעות אשר הם בדרך כלל הרבה יותר נוטה ובעייתי כאשר לכימות האות יון קודמן MS1 (כמו חלק מן הפרסומים הקודם הראו).

ניתן לבצע מספר שינויים בזרימת עבודה בעת הכנת דוגמאות מורכבות מאוד. מספר שברים איחדו לאחר הניתנות להפחתה של basic-pH הפוך-פאזי HPLC fractionation מנותק כדי להפחית את המורכבות של הדגימות במאגר זה לרכוש על ידי LC/גב בנוסף, עוד כרומטוגרפי מעברי צבע יכול גם לשמש במהלך רכישת כדי לאפשר הפרדה פפטיד טוב יותר. לחלופין, ניתן להשתמש פרוטאזות מרובים לעכל את דגימות לייצר מגוון גדול יותר של פפטידים cleaved ולהגדיל את הסיקור של שאריות ליזין חלבון. . האקסאלסיור ואופטימיזציה יכול להתבצע באמצעות BSA מסחרי המכיל באחוזים מסוימים של acetylation או succinylation.

מגבלה אחת על פרוטוקול זה היא אתר פוטנציאלי קלה מופרזת תפוסת בשל נרשמה שינויים ליזין אחרים, כגון מתילציה או ubiquitination, וכדומה, באותו אתר⁴. מחושב מאזורי שיא של ליפיד קל וכבד שינויים, L/(L+H), והתפוסה באתר זה מבוסס על ההנחה כי הרמה הכוללת של השינוי באתר ליזין מורכב acylation ‘אור’ רק אנדוגני (L) ומתויגים כימית ‘כבדים’ acylation (H). עם זאת, והתפוסה acylation הכולל בפועל האתר ויוו עשויים לכלול שינויים אחרים מעבר acetylation ו/או succinylation. בנוסף, את טוהר איזוטרופי המדווחת של ריאגנטים שנרכשו אנהידריד אצטית –d₆ (99%) ואת סוקסינית אנהידריד –d₄ (> 98%) עשוי לתרום מופרזת קטן של עד 2% (succinyl) או 1% (אצטיל) acylation אנדוגני רמה⁴. יחד, אלה overestimations קלה להוסיף הקושי לכימות אתרים עם פחות מ 1% תפוסה. שפע גדול ההבדלים בין להשלים כימית acylated פפטידים של פפטידים acylated מקורי גם לתרום האתר תפוסת כימות שגיאות פוטנציאליות, במיוחד עבור acylated אנדוגני נמוך פפטידים²⁷. מחקר שנערך לאחרונה על ידי Weinert et al. ²⁷ מצא כי ירידה שפע ההבדלים בין פפטידים מלאה לכל acetylated יכול להפחית את השגיאה של כימות²⁷.

Quantifications סטויכיומטריה שנאספו באמצעות פרוטוקול זה יכול לאתר נקודות חמות acylation חשוב ב השערות חלבון ו טופס מסוים לניסויים להמשך טיפול ביולוגי, כגון מוטגנזה של אתרים מסוימים של עניין. פרוטוקול זה גם יכול לחשוף בשילוב השפעות acylation נמוך סטויכיומטריה אתרי יכול להפעיל השפעות עקיפות או עדין על יציבות מבנית חלבון מקומי סביבות הסלולר. בנוסף, יישום של פרוטוקול זה כדי למדוד את acetylation ואת succinylation ושינויים אחרים אפשריים ליזין acylation מעבר acetylation באופן ייחודי מציע תובנות ההשפעות acylation דינמי על חלבונים תחת שונות התנאים הביולוגיים.

Materials

aqueous acetic anhydride-d6	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	175641-1G	1% isotopic purity
succinic anhydride-d4	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	293741	2% isotopic purity
sequencing grade endoproteinase Glu-C	Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma)	10791156001	1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt)
Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT 094225
HPLC acetonitrile	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJAH015-4
HPLC grade water	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJAH365-4
iodoacetamide	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	I1149-25G
dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9779-5G
FLUKA formic acid (FA) for mass spec	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA	C988C27	~98%
urea	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	PI29700
bovine serum albumin (BSA)	Pierce, Rockford, IL, USA	88341
triethylammonium bicarbonate (TEAB)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	T7408-100ML
anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO)	Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA	43998
sodium hydroxide (NaOH)	EMDMillipore, Burlington, MA, USA	SX0590
50% hydroxylamine solution in water	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	438227-50ML
LC-MS grade water	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJLC365-4
LC-MS acetonitrile	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA	BJLC015-4
Eppendorf Themomixer Compact	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	T1317-1EA
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	SPD131DDA-115
Waters 1525 binary HPLC pump system	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT081110
Waters 717plus Autosampler	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Waters Fraction Collector III	Waters Corp., Milford, MA, USA	186001878
Agilent Zorbax 300Extend C18 column	Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA	770995-902
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer	Labconco, Kansas City MO, USA	7751000
indexed retention time (iRT) normalization peptide standard	Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland	Ki-3002-2
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system	Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA	model# 845
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	per quote
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	per quote
C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00006
SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	software download Sciex
Spectronaut	Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland	Sw-3001
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00001