여기, 우리가 특정 단백질 acetylation 또는 succinylation 인 (산출할) 생 수정 수정 후 도입의 비율 분석을 통해 전체 프로테옴의의 편견된 정량화 제시 양적 화학 acylation 안정 동위 원소 표시 된 anhydrides를 사용 하 여입니다. 함께 중요 한 독립적인 데이터 수집 질량 분석, 정확한 사이트 인 측정 얻을 수 있습니다.
NƐ-acylation에 의해 단백질 리 진 잔류물의 포스트 번역 상 수정 (PTM) 수 동적으로 정돈해 단백질 기능, 예를 들어 효소 활동을 변경 하 여 또는 상호 작용을 중재 하 여 구조적인 변화를 유도 합니다. 사이트별 단백질 acylation 인, 또는 산출할, 정확한 정량화 글로벌 수준의 산출할와 특정 신의 개별 고급 acylation 산출할의 기능적인 결과 이해 하기 위한 필수적 이다 잔류물입니다. 다른 그룹 내 생, 자연의 풍요로 움 acylation에서 펩 티 드 선구자 동위 원소의 비율을 비교 하 여 lysine acetylation 산출할의 측정 보고와 외 인, 무거운 동위 원소 표시 acylation 도입 후 양적 안정 동위 원소 분류 아세트산 무수 물을 사용 하 여 단백질의 화학 acetylation. 이 프로토콜 최적화 방법 등 여러 가지 개선 기능을 설명 합니다: (1) 화학 acylation 효율성, (2) acetylation, 뿐만 아니라 단백질 succinylation를 측정 하는 능력 증가 하 고 (3)로 인해 양적 정확도 향상 데이터 의존 인수 (DDA) 선구자 이온 신호 대신 데이터 독립적인 인수 (디 아)에서 조각 이온 정량화를 사용 하 여 감소 된 방해. 정량화에 대 한 조각 이온에서 추출 된 피크 넓이의 사용은 또한 고유 사이트 수준 acylation 산출할 불가능 선구자 이온을 사용 하 여 하나 이상의 lysine 잔류물을 포함 하는 분해 펩 티 드에서의 수 있습니다. 정량화에 대 한 신호입니다. 편리한 데이터 검사 및 검토에 대 한 스카이 라인, 오픈 소스 양이 많은 proteomics 환경 데이터 시각화 수 있습니다. 함께,이 워크플로 계시 하 고 생물학으로 관련 acylation 사이트 순위 수는 전체 프로테옴의 사이트별 lysine acetylation 및 succinylation 점령의, 정확, 공평 하 고 정확한 정량화를 제공 합니다.
NƐ-acylation 단백질 리 진 잔류물의 단백질 기능의 중요 한 레 귤 레이 터 이다. Lysine acetylation 및 다른 acylations, succinylation, malonylation, glutarylation, 등 대사, 세포 신호, 및 다른 세포질 과정1,2,3,4 생각 된다 , 신진 대사 장애5에 있는 의미. Lysine acyl 수정 포유류 조직에서 서로 다른 조건 하에서 큰 배-변화를 받아야 하 고 셀 라인5,6,,78 수많은 연구 발견 뿐만 아니라 그러나 박테리아9,,1011,, 이러한 상대 배 변경 제공 하지 않습니다 수정 총 단백질의 비율에 대 한 통찰력. 연구 보고 acylation 사이트 점령의 측정 부족12,,1314, 관련성에도 불구 하 고 상대 배 보다 더 자세한 정보를 제공 하는 그들은 이러한 연구에 필요한 변경 합니다. 예를 들어 사진 변경 0.1%, 1 ~ 10%, 또는 심지어 10 ~ 100 %0.01에서 사이트 인 증가 대표할 수 있었다. 정확 하 게 산출할 측정은 필요한 acylation의 생물학적 의미를 해석 하 고 구조, 단백질의 크기에 대 한 영향 예측 가능성, 기능 변경.
뒤에 비해 외 인, 내 인 성 “빛” acetylation 사이의 비율을 측정 하는 질량 분석에 의해 수정 되지 않은 리 진 잔류물의 무거운는 안정 동위 원소 화학 라벨 사이트 인 척도를 한 이전 방법 활용 화학적으로 표시 된 “무거운” 틸 리 선구자 이온 농도12를 사용 하 여. 저 우 외다른 최근 연구. 13 lysine acetylation 산출할 또한 안정 동위 원소, 단백질에서 모든 수정 되지 않은 리 진 잔류물의 완전 한 화학 acetylation 고용 하지만 조각 이온 농도 의해 측정 된 사용을 평가 하는 유사한 접근 방식을 설명 DDA 협상입니다. 나카 야 스 외. 14 비슷한 DDA 접근 방식을 사용 하지만 대신 빛과 무거운 틸 리 immonium 이온의 비율을 사용 하는 정량화에 대 한. 정량화 파편 이온에 따라 그대로 펩 티 드 선구자 이온 (MS1) 처리에 비해 적은 신호 간섭에 대부분의 경우 결과에 immonium 또는 시퀀스 이온 (MS2). 그러나, DDA 생성 MS/MS 스펙트럼에서 조각 이온의 정량화에서 확률적 샘플링 결함, MS/MS에 대 한 선택 되 고 따라서,의 치 우 치고 다 불완전 한 샘플링으로 이어질 가능성이 더 높은 풍부 선구자 이온이은 겪을 수 있다 선구자 이온입니다.
이 소설 워크플로4 (그림 1) 개념적으로 안정 동위 원소 화학 라벨 바 외에 의해 원래 개발 접근 방식을 사용 합니다. 그러나 12, 워크플로 이후에 결합 디 아 모두 전조를 수집 하 고 여러 조각 이온 나타났는데 감지 질량에 범위15,16 정확 하 게 산출할 계산을 제공 하.
피크 넓이에서 조각 관심, acylation 사이트를 포함 하는 이온 또는 acylation 사이트 인 (그림 2)를 계량 하는 데 사용 됩니다 ‘조각 이온 차별화’. 조각 이온 수정 포함 되지 않은 동일한 빛과 무거운 m/z 값, 고 정량화 하지만 펩 티 드 식별을 위해 사용 됩니다. 스카이 라인 소프트웨어17 전조 및 조각 피크 영역을 추출 하는 데 사용 됩니다. 주어진된 acylation 사이트를 포함 하는 여러 개의 조각 이온의 존재는 간섭 조각 이온의 일부에서 검색 되 면 유연성을 제공 합니다. 가벼운-무거운 조각 이온 비율의 중요 한 검사에 대 한 스카이 라인 데이터 시각화 수 있습니다. 수동 데이터 분석 이외에 자체, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR)를 작성 하는 오픈 소스 R 패키지 개발 되었다,이 데이터를 사용 하는 선구자 이온 및 조각 이온 디 아를 통해 수집 하 고 단정 사이트별 acylation 산출할 펩 티 드 포함 여러 리 진 잔류물, 선구자 이온 전용 강도 측정4불가능 기능에서.
이 프로토콜은 또한 endoproteinase Glu-C, 글루타민, aspartic 산 성 잔류물, 후자는 종종 매우 큰 생성 하 고 잠재적으로 증식 트립 신 또는 Arg C 효소를 사용 하는 대신에 C 터미널 분열에 대 한 특정의 사용 방법을 보여 줍니다. acylated 분해 펩 티 드에서 유래한 acylated 리 진 잔류물에 트립 신 분열을 차단. 화학 절차 라벨은 또한 호박 무수 물 (그림 1), succinylation 산출할 succinylation의 정량화 함으로써의 사용을 포함 하도록 확장 됩니다. 샘플 준비, 오프 라인, 기본 산도 의해 펩 티 드 분별 법의 구현에 개선 뿐만 아니라 더 펩 티 드의 반전 위상 (bRP) 분리 정량화 방해의 더 나은 드 회선 수 감소 acylation 산출할 전체 프로테옴 샘플에. 함께,이 방법을 기능과 여러 가지 이점을 강조: 화학 acylation;의 효율성 향상된 (1) (2) 단백질 succinylation 산출할 acetylation; 외의 측정 그리고 (3) 향상 된 정량화 정확도입니다. 향상 된 정량화 bRP에 의해 오프 라인 펩 티 드 사전 분류의 구현 뿐 아니라 DDA 전조 신호에 비해 디 아에서 조각 이온 신호 감소 방해 때문 이다.
이 프로토콜에는 소설과 정확한 방법 사이트별 lysine acetylation와 전체 proteome에 적용 될 수 있는 succinylation 인 척도를 제공 합니다. 이 방법은 생 빛 펩 티 드와 외 인 무거운 펩 티 드, 후자는 생성 되 체 외에서 deuterated 아세트산 무수 물-d6 단백질의 정량적 화학 acylation를 사용 하 여 측정에 의존 또는 호박 무수 물-d4 (그림 1). 비슷한 메서드는 네이티브 수정 되지 않은 리 진 잔류물의 안정 동위 원소 라벨 사용 하 고 어느 선구자 이온 전용12 또는 조각 이온 DDA 인수13,14에서 따라 사이트 인 정량화를 수행. 이 프로토콜 acylation 효율 향상을 위해 견본 준비 동안 여러 단계를 적용 하 고 succinylation를 화학 라벨을 확장 합니다. 디 아 인수를 사용 하 여 데이터 컬렉션을 가져옵니다 선구자 이온과 MS2 조각 이온 농도를 조각 이온 간섭 감소 전체 감지 대량 범위. 분석 및 정량화 스카이 라인 및 자체 개발 하는 사용자 지정 스크립트를 통해 하나 이상의 리 진 잔류물과 하나의 사이트에서 하나 이상의 acylation를 포함 하는 펩 티 드에 대 한 사이트 인 계산을 수 있습니다.
밀접 하 게 따라 합니다이 프로토콜의 샘플 준비 단계에서 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 때문에 전체 프로토콜 모든 리 진 잔류물의 효율적인 화학 수정에 의존,이 단계는 매우 중요. Anhydrides lysate 단백질에서 포함 하는 아민 버퍼 또는 오염 물질 분자를 피해 야 한다 그래서 자유로운 아민으로 반작용 한다. 또한 화학 당 acylation 단계는 반응 혼합물의 pH 조정 됩니다 다시 pH 8 후 무수 물 시 약으로 3 개의 외피의 각이 반응 혼합물을 산성화 하 고 O-acylation 측 반응 양식을 수 있습니다 확인 합니다. 또한, 8 M 요소 포함 된 반응 혼합물에 최적의 범위 내에서 pH는 소화와 검사 전에 0.8 M 요소 주위의 희석은 Glu C. endoproteinase의 최적 활동에 대 한 중요 한 우리의 프로토콜의 또 다른 핵심 구성 요소는 모든 DDA 데이터 샘플링 불일치를 극복 하 고 MS2 조각 이온 수준 정량화에 대 한 수 있는 디 아 작업의 소개와 데이터 수집 단계입니다. 디 아 방법론의 주요 장점 중 하나는 일반적으로 훨씬 더 경향이 문제 (로 이전 간행물의 일부 제안) MS1 선구자 이온 신호를 측정 하는 때 방해의 감소 이다.
매우 복잡 한 샘플을 준비할 때 워크플로에 여러 수정 할 수 있다. 풀링 후 오프 라인 기본 상 반전 단계 HPLC 분별 낮은 LC/양 또한, 더 이상 컬럼에 그라디언트 수에 의해 또한 인수는 풀링된 샘플의 복잡성 감소 수 분수의 수 중에 사용 될 더 펩타이드 분리 수 있도록 인수입니다. 또는, 여러 프로 테아 제 소화 쪼개진된 펩 티 드의 큰 다양 한 생산 단백질 리 진 잔류물의 범위를 증가 하는 샘플을 사용할 수 있습니다. 시운전 및 최적화 acetylation 또는 succinylation의 특정 백분율을 포함 하는 상업 BSA를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
한 제한은이 프로토콜입니다로 인해 잠재적으로 약간의 사이트 인과 메 틸 화 또는 ubiquitination, 등, 동일한 사이트4다른 신 수정, 걸렸다. 빛과 무거운 acyl 수정, L/(L+H)의 피크 넓이에서 계산 사이트 인은 리 사이트에서 수정의 총 수준만 생 ‘빛’ acylation (L)의 구성 하는 가정에 기초 하 고 화학적 ‘무거운’ 표시 acylation (H)입니다. 그러나, 한 사이트에서 에서 vivo에서 실제 총 acylation 인 acetylation 및/또는 succinylation를 넘어 다른 수정 내용을 포함할 수 있습니다. 또한, 구입한 시 약 아세트산 무수 물-d6 (99%)와 호박 무수 물-d4 의 보고 된 동위 원소 순수성 (> 98%)의 1% (틸) 또는 최대 2% (succinyl)의 작은 과대평가에 기여할 수는 내 인 성 acylation 레벨4. 함께, 이러한 약간의 과대평가 사이트 1% 미만으로 측정에 어려움에 추가 인. 완전 한 큰 풍부 차이 화학적 acylated 펩 티 드 및 네이티브 acylated 펩 티 드 또한 기여할 잠재적인 사이트 인 정량화 오류, 특히 낮은 생 acylated 펩 티 드27. Weinert 외최근 연구. 27 감소 풍부한 차이 완전 한 당 acetylated 펩 티 드27정량화 오류 줄일 수 있습니다 발견.
이 프로토콜을 사용 하 여 수집 산출할 quantifications 관심의 특정 사이트의 사이트 감독 mutagenesis와 같은 생물 학적 후속 실험에 대 한 특정 단백질 및 양식 가설에 중요 한 acylation 핫스팟 정확 하 게 수 있습니다. 이 프로토콜은 낮은 acylation 산출할 사이트 단백질 구조 안정성에 간접 또는 미묘한 영향을 발휘할 수 있는 셀룰러 환경 지역화의 결합된 효과 밝힐 수 수 있습니다. 또한, acetylation 및 succinylation 및 다른 가능한 lysine acylation 수정 acetylation 넘어 측정 하이 프로토콜의 구현 고유에서 다른 단백질에 동적 acylation 효과에 대 한 통찰력 제공 생물 학적 조건입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 NIH 국립 연구소의 당뇨병에 의해 지원 되었다 및 소화기 및 신장 질환 NIH-NIDDK 부여 R24 DK085610 (PI: E. Verdin). JGM NIH T32 친교에 의해 지원 되었다 (T32 AG000266, PI: J. Campisi). 저자는 NIH에서 지원 공유 벅 연구소 TripleTOF 6600 시스템에 대 한 계측 부여 인정 (1S10 OD016281, PI: 들어 깁슨).
aqueous acetic anhydride-d6 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 175641-1G | 1% isotopic purity |
succinic anhydride-d4 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 293741 | 2% isotopic purity |
sequencing grade endoproteinase Glu-C | Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) | 10791156001 | 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt) |
Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT 094225 | |
HPLC acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH015-4 | |
HPLC grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH365-4 | |
iodoacetamide | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
FLUKA formic acid (FA) for mass spec | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | C988C27 | ~98% |
urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
bovine serum albumin (BSA) | Pierce, Rockford, IL, USA | 88341 | |
triethylammonium bicarbonate (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408-100ML | |
anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | 43998 | |
sodium hydroxide (NaOH) | EMDMillipore, Burlington, MA, USA | SX0590 | |
50% hydroxylamine solution in water | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 438227-50ML | |
LC-MS grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC365-4 | |
LC-MS acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC015-4 | |
Eppendorf Themomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 | |
Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer | Labconco, Kansas City MO, USA | 7751000 | |
indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | model# 845 | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 |