Hier presenteren wij onbevooroordeelde kwantificering van site-specific eiwit acetylation en/of succinylation bezetting (stoichiometrie) van een volledige Proteoom door middel van een analyse van de ratiometric van endogene aangebrachte wijzigingen na kwantitatieve chemische acylering met behulp van stabiele isotoop-geëtiketteerden anhydriden. In combinatie met de Spectrometrie van de massa van de gevoelige gegevens-onafhankelijke acquisitie, worden nauwkeurige site bezetting metingen verkregen.
Posttranslationele wijziging (PTM) van eiwit lysine residuen door NƐ– acylering induceert structurele veranderingen die dynamisch eiwitfuncties, reguleren kunnen, bijvoorbeeld door enzymatische activiteit te wijzigen of door bemiddeling van interacties. Precieze kwantificering van site-specific eiwit acylering bezetting of stoichiometrie, is van essentieel belang voor het begrijpen van de functionele gevolgen van zowel globale low-level Stoichiometrie en individuele op hoog niveau acylering stoichiometrie van specifieke lysine residuen. Andere groepen hebben melding gemaakt van meting van lysine acetylation stoichiometrie door vergelijking van de verhouding van peptide voorloper isotopen van endogene, natuurlijke overvloed acylering en exogene, zware isotoop-geëtiketteerden acylering geïntroduceerd na kwantitatieve chemische acetylation van eiwitten met behulp van stabiele isotoop-geëtiketteerden azijnzuur-anhydride. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde aanpak met verscheidene verbeteringen, waaronder: (1) verhoogde chemische acylering efficiëntie, (2) de mogelijkheid voor het meten van eiwit succinylation naast acetylation, en (3) verbeterd kwantitatieve nauwkeurigheid gevolg verminderde storingen met fragment ion kwantificering van gegevens-onafhankelijke acquisities (DIA) in plaats van voorloper ion signaal van gegevens-afhankelijke acquisition (DDA). Het gebruik van uitgepakte piek gebieden van fragment ionen voor kwantificering kan ook uniek differentiatie van op siteniveau acylering stoichiometrie van Proteolytische peptiden met meer dan één lysine residu, wat niet mogelijk met behulp van de voorloper van ion signalen voor kwantificering. Data visualisatie in Skyline, een open source kwantitatieve proteomics omgeving, zorgt voor gemakkelijk gegevens controle en beoordeling. Deze workflow biedt samen, onpartijdige, nauwkeurige en correcte kwantificering van site-specific lysine acetylation en de succinylation bezetting van een hele Proteoom, die kan onthullen en prioriteren van biologisch relevante acylering sites.
NƐ– acylering van eiwit lysine residuen is een belangrijke regulator van eiwitfunctie. Lysine-acetylation en andere organische, zoals succinylation, malonylation en glutarylation, worden verondersteld om te regelen van de stofwisseling, cel signalering en andere cellulaire processen1,2,3,4 , en gevolgen hebben in metabolische wanorde5. Talrijke studies hebben geconstateerd dat lysine acyl wijzigingen ondergaan grote vouw-veranderingen onder verschillende omstandigheden in zoogdieren weefsels en cell lijnen5,,6,,7,8 , evenals bacteriën9,10,11, echter deze relatieve vouw veranderingen bieden geen inzicht in het aandeel van de totale proteïne bewerkt. Studies rapporteren metingen van acylering site bezetting zijn schaars12,13,14, ondanks de relevantie en behoefte aan dergelijke studies, aangezien zij meer detail dan de relatieve vouw bieden wijzigen. Een 10-fold verandering kon vertegenwoordigen bijvoorbeeld de verhoging van de bezetting van een site van 0,01 tot 0,1%, 1 tot en met 10% of zelfs 10 tot 100%. Nauwkeurige stoichiometrie metingen zijn vereist te interpreteren biologische betekenis van acylering en te voorspellen gevolgen met betrekking tot de omvang van de structurele, eiwit en eventueel, functionele veranderingen.
Een vorige methode te kwantificeren van de bezetting van de site maakt gebruik van zware testing-isotoop chemische labeling van ongewijzigde lysine residuen gevolgd door Spectrometrie van de massa te meten van de verhouding tussen endogene “light” acetylation in vergelijking met de exogene, chemisch-geëtiketteerden “zware” acetyl-lysine voorloper ion intensiteiten12gebruikt. Een andere recente studie door Zhou et al. 13 beschreven een soortgelijke aanpak om te beoordelen van lysine acetylation stoichiometrie die ook een volledige chemische acetylation van alle ongewijzigde lysine residuen in eiwitten met stabiele isotoop labeling aangewend, maar fragment ion intensiteiten zoals gemeten door ONTWIKKELINGSAGENDA VAN DOHA. Nakayasu et al. 14 een soortgelijke aanpak van de DDA gebruikt, maar in plaats daarvan gebruikt de verhouding van lichte en zware acetyl-lysine immonium ionen voor kwantificering. Kwantificering op basis van fragment ionen, immonium of sequentie ionen (MS2), in de meeste gevallen resulteert in minder signaal storingen in vergelijking tot de verwerking van ionen (MS1) voorloper intact peptide. Echter, kwantificering van fragment ionen uit DDA gegenereerde MS/MS-spectra kan lijden stochastische bemonstering tekortkomingen, waar de voorloper van de hoge-overvloed-ionen zijn meer kans om te worden geselecteerd voor MS/MS en dus leiden tot een partijdig en onvolledig bemonstering van voorloper van de ionen.
Deze nieuwe werkstroom4 (Figuur 1) gebruikt conceptueel een stabiele isotoop chemische aanpak oorspronkelijk ontwikkeld door Baeza et al.labeling. 12, echter is de werkstroom vervolgens gekoppeld aan DIA te verzamelen van zowel voorloper en meerdere fragment ion abundanties over de detecteerbare massa variëren15,16 verstrekken van nauwkeurige stoichiometrie berekeningen.
Piek gebieden van fragment ionen die de site acylering van belang bevatten, of ‘differentiëren fragment ionen’, worden gebruikt om te kwantificeren acylering site bezetting (Figuur 2). Fragment ionen die de wijziging geen identieke lichte en zware m/z-waarden, en worden gebruikt voor peptide identificatie, maar niet voor de kwantificering. Skyline software17 wordt gebruikt voor het uitpakken van de voorloper en fragment piek gebieden. De aanwezigheid van meerdere fragment ionen met een bepaalde acylering-site biedt flexibiliteit als storingen worden aangetroffen in enkele van de fragment-ionen. Data visualisatie in Skyline zorgt voor kritische inspectie van licht-tot-zware fragment ion ratio’s. Naast handmatige data-analyse, werd een open-source R pakket geschreven in eigen huis, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), ontwikkeld, die de voorloper ion en fragment ion gegevens verzameld door middel van de DIA worden gebruikt en kwantificeert Sitespecifiek acylering stoichiometrie van peptiden die meerdere lysine residuen, een functie die niet mogelijk zijn met voorloper alleen-ion intensiteit metingen4.
Dit protocol ook demonstreert het gebruik van endoproteinase Glu-C, die specifiek is voor C-terminal decollete op glutaminezuur en asparaginezuur residuen, in plaats van het gebruik van tripsine of Arg-C protease, als de laatste vaak zeer grote produceren en potentieel vermenigvuldigen GEACYLEERDE Proteolytische peptiden als gevolg van geblokkeerde trypsine decollete op GEACYLEERDE lysine residuen. De chemische stof labeling procedure werd ook uitgebreid met gebruik van succinic anhydride (en) (Figuur 1), waardoor de kwantificering van succinylation stoichiometrie succinylation. Naast verbeteringen aan de bereiding van de monsters, de uitvoering van peptide fractionering door offline, fundamentele pH, daalde omgekeerd-(bRP) fasenscheiding van peptiden verder kwantificering storingen, waardoor betere ambtshalve convolutie van acylering stoichiometrie in hele Proteoom monsters. Samen, deze methode beschikt en hoogtepunten van verschillende voordelen: (1) verhoogde efficiëntie van chemische acylering; (2) meting van eiwit succinylation stoichiometrie naast acetylation; en (3) verbeterde kwantificering nauwkeurigheid. De verbeterde kwantificering is te wijten aan verminderde storingen in fragment ion signalen van DIA in vergelijking met de DDA voorloper signaal, alsmede de uitvoering van off-line peptide pre fractionering van bRP.
Dit protocol biedt een roman en nauwkeurige methode te kwantificeren site-specific lysine acetylation en bezetting van de succinylation die kan worden toegepast op een hele Proteoom. Deze methode is gebaseerd op meting van endogene lichte peptiden en exogene zware peptides, de laatste van die zijn gegenereerd in vitro kwantitatieve chemische acylering van eiwitten met Halfzwaar azijnzuur anhydride –d6 of Succinic anhydride (en) –d4 (Figuur 1). Soortgelijke methoden hebben gebruikt stabiele isotopische labeling van inheemse ongewijzigde lysine residuen en uitgevoerd site bezetting kwantificering op basis van beide voorloper alleen-ion12 of fragment ionen van13,14van de overnames van de DDA. Dit protocol geldt verschillende stappen tijdens de bereiding van de monsters voor acylering-efficiëntie en breidt de chemische labeling te succinylation. Verzamelen van de gegevens met behulp van DIA acquisities verkrijgt zowel MS2 fragment als voorloper ion ion intensiteiten over het gehele detecteerbare massa bereik, waardoor de fragment ion storingen. Analyse en kwantificering via Skyline en aangepaste scripts intern ontwikkeld zodat de site bezetting berekening voor peptides met meer dan één lysine residu en meer dan één acylering op één site.
Er zijn verschillende kritische stappen tijdens de fase van de bereiding van het monster van dit protocol dat dient strak gevolgd te worden. Aangezien het gehele protocol is afhankelijk van efficiënte chemische modificatie van alle lysine residuen, is deze stap van het allergrootste belang. Afgeleide anhydriden reageren met gratis amines, zodat amine-bevattende buffer of verontreinigingen moleculen in het eiwit lysate moeten worden vermeden. Ook tijdens de chemische per-acylering stap, ervoor zorgen dat de pH van het reactiemengsel terug naar pH 8 na elk van de drie incubations met zwavelzuuranhydride reagens wordt aangepast als deze reactie het mengsel verzuurt, en O-acylering kant-reacties kunnen vormen. Bovendien is verdunning van de 8 M ureum-bevattende reactiemengsel aan rond 0,8 M ureum voorafgaand aan de spijsvertering en controleren dat de pH binnen het optimale bereik ligt belangrijk voor de optimale activiteit van de endoproteinase Glu-C. Een ander belangrijk onderdeel van ons protocol is de stap van de collectie gegevens en de invoering van een DIA-workflow, die overwint inconsistenties gegevens bemonstering DDA en waarmee voor kwantificering niveau MS2 fragment ion. Een belangrijkste voordeel van de methodologie van de DIA is de daling van de storingen die doorgaans veel meer geneigd en problematisch wanneer de MS1 voorloper ion signaal te kwantificeren (zoals sommigen van de eerdere publicaties hebben gesuggereerd).
Verschillende wijzigingen aan de workflow kunnen worden gemaakt bij de voorbereiding van zeer complexe monsters. Het aantal breuken samengevoegd nadat de off line basic-pH omgekeerd-fase HPLC fractionering kan worden verlaagd om de complexiteit van de samengevoegde monsters die zal worden verworven door LC/MS. bovendien langer chromatografische verlopen kan ook lager worden gebruikt tijdens overname te voorzien in betere scheiding van de peptide. Meerdere proteasen kunnen ook, worden gebruikt om te verteren monsters te produceren van een grotere verscheidenheid van gekloofd peptiden en vergroten van de dekking van eiwit lysine residuen. Proef runs en optimalisatie kunnen worden uitgevoerd met gebruikmaking van commerciële BSA met specifieke percentages van acetylation of succinylation.
Een beperking bij dit protocol is potentieel lichte site bezetting overschatting wijten aan andere lysine wijzigingen, zoals methylering of ubiquitination, etc., op dezelfde site4vermist. Berekend op basis van de gebieden van de piek van lichte en zware acyl wijzigingen, L/(L+H), is de bezetting van de site gebaseerd op de veronderstelling dat het totale niveau van de wijziging op een lysine-site uit alleen endogene ‘light’ acylering (L bestaat) en chemisch met het label ‘zwaar’ acylering (H). Echter, de werkelijke totale acylering bezetting op een site in vivo eventueel andere wijzigingen dan acetylation en/of succinylation. Bovendien, de gerapporteerde isotopische zuiverheid van de aangekochte reagentia azijnzuur anhydride –d6 (99%) en succinic anhydride (en) –d-4 (> 98%) kan bijdragen aan een kleine overschatting van maximaal 2% (succinyl) of 1% (acetyl) van de endogene acylering niveau4. Samen, deze lichte overestimations toevoegen aan de moeilijkheid in het kwantificeren van sites met minder dan 1% bezetting. Grote overvloed verschillen tussen de complete chemisch GEACYLEERDE peptiden en de inheemse GEACYLEERDE peptiden ook bijdragen tot potentiële site bezetting kwantificering fouten, vooral voor lage endogene GEACYLEERDE peptiden27. Een recente studie door Weinert et al. 27 gevonden dat verminderde overvloed verschillen tussen volledige per-geacetyleerd peptiden de kwantificering fout27 verminderen kunnen.
Stoichiometrie ondermeer verzameld met behulp van dit protocol kunnen het lokaliseren van belangrijke acylering hotspots in een bepaald eiwit en formulier hypothesen voor biologische follow-up experimenten, zoals plaats-geleide mutagenese van bepaalde gebieden van belang. Dit protocol kan onthullen ook gecombineerde effecten van lage acylering stoichiometrie sites die indirecte of subtiele invloeden op structurele eiwitstabiliteit kunnen uitoefenen en een gelokaliseerde cellulaire omgevingen. Daarnaast zou uitvoering van dit protocol voor het meten van acetylation en succinylation en andere mogelijke lysine acylering wijzigingen buiten acetylation uniek bieden inzicht in de effecten van de dynamische acylering op eiwitten onder verschillende biologische omstandigheden.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de NIH nationale Instituut van Diabetes en de spijsverterings en nier-ziekten NIH-NIDDK verlenen R24 DK085610 (PI: E. Verdin). JGM werd gesteund door een NIH T32 fellowship (T32 AG000266, PI: J. Campisi). De auteurs erkennen dat steun van de NIH gedeeld instrumentatie subsidie voor de TripleTOF 6600-systeem op de Buck Instituut (1S10 OD016281, PI: B.W. Gibson).
aqueous acetic anhydride-d6 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 175641-1G | 1% isotopic purity |
succinic anhydride-d4 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 293741 | 2% isotopic purity |
sequencing grade endoproteinase Glu-C | Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) | 10791156001 | 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt) |
Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT 094225 | |
HPLC acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH015-4 | |
HPLC grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH365-4 | |
iodoacetamide | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
FLUKA formic acid (FA) for mass spec | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | C988C27 | ~98% |
urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
bovine serum albumin (BSA) | Pierce, Rockford, IL, USA | 88341 | |
triethylammonium bicarbonate (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408-100ML | |
anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | 43998 | |
sodium hydroxide (NaOH) | EMDMillipore, Burlington, MA, USA | SX0590 | |
50% hydroxylamine solution in water | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 438227-50ML | |
LC-MS grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC365-4 | |
LC-MS acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC015-4 | |
Eppendorf Themomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 | |
Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer | Labconco, Kansas City MO, USA | 7751000 | |
indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | model# 845 | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 |