Qui, presentiamo imparziale quantificazione di occupazione acetilazione e/o succinylation site-specific protein (stechiometria) di un intero proteoma attraverso un’analisi raziometrici endogeno modifiche modifiche introdotte dopo quantitativa Acilazione chimica utilizzando anidridi con etichetta isotopo stabile. In combinazione con spettrometria di massa sensibile acquisizione dati-indipendente, sito accurata occupazione misurazioni sono ottenute.
Modificazione post-traduzionale (PTM) di residui di lisina della proteina diƐN – acilazione induce cambiamenti strutturali in grado di regolare dinamicamente funzioni della proteina, per esempio, modificando l’attività enzimatica o mediando interazioni. Quantificazione precisa di occupazione acilazione della proteina site-specific, o di stechiometria, è essenziale per comprendere le conseguenze funzionali di stechiometria di basso livello globale sia individuali ad alto livello acilazione stechiometria di lisina specifico residui. Altri gruppi hanno segnalato misura della stechiometria di acetilazione di lisina confrontando il rapporto degli isotopi di precursore del peptide da endogeno, naturale abbondanza acilazione ed esogeno, pesante isotopo-labeled acilazione introdotto dopo quantitativa chimico acetilazione delle proteine usando acetica con etichetta isotopo stabile. Questo protocollo descrive un approccio ottimizzato con diversi miglioramenti, tra cui: (1) una maggiore efficienza chimica acilazione, (2) la capacità di misurare succinylation proteina oltre a acetilazione e (3) migliorata la precisione quantitativa a causa interferenze ridotte mediante quantificazione ioni frammento da acquisizioni dati-indipendente (DIA) invece di precursore dello ione segnale dall’acquisizione dati-dipendente (DDA). L’uso delle aree dei picchi estratti dagli ioni frammento per quantificazione anche in modo univoco consente la differenziazione della stechiometria di livello di sito acilazione da proteolitici peptidi contenenti più di un residuo di lisina, che non è possibile utilizzando ioni precursore segnali per la quantificazione. Visualizzazione dei dati in Skyline, un ambiente di proteomica quantitativa di open source, consente per la revisione e controllo dei dati conveniente. Insieme, questo flusso di lavoro offre imparziale, precisa e accurata quantificazione di occupazione di acetilazione e succinylation di lisina site-specific di un intero proteoma, che può rivelare e prioritizzare acilazione biologicamente rilevanti siti.
NƐ– acilazione di residui di lisina della proteina è un importante regolatore della funzione della proteina. Acetilazione di lisina e altri acylations, come succinylation, malonylation e glutarylation, sono pensati per regolare il metabolismo, segnalazione delle cellule e altri processi cellulari1,2,3,4 , e hanno implicazioni nei disordini metabolici5. Numerosi studi hanno trovato che le modifiche dell’acilico di lisina subiscono grande piega-cambiamenti in condizioni diverse in tessuti di mammiferi e cellulari linee5,6,7,8 , nonché batteri9,10,11, tuttavia, queste modifiche relativa piega non fornire intuizioni la proporzione delle proteine totali per volta. Gli studi che segnalano misure di occupazione del sito di acilazione rimangono scarse12,13,14, nonostante la rilevanza e bisogno per tali studi in quanto forniscono più dettaglio relativo piega cambiano. Ad esempio, un cambiamento di 10 volte può rappresentare un aumento di occupazione del sito da 0,01 a 0,1%, 1 al 10% o persino 10 al 100%. Sono necessarie per interpretare il significato biologico di acilazione e prevedere impatto per quanto riguarda la grandezza delle proteine strutturale, stechiometria accurate misurazioni e, eventualmente, modifiche funzionali.
Un precedente metodo per quantificare il numero di persone: sito utilizza pesante dell’isotopo stabile chimica etichettatura dei residui di lisina non modificato seguite da spettrometria di massa per misurare il rapporto tra acetilazione endogeno “leggero” rispetto ai esogeno, chimicamente-labeled “pesante” acetile-lisina utilizzando precursore dello ione intensità12. Un altro studio recente di Zhou et al. 13 descritto un approccio simile per valutare la stechiometria di acetilazione di lisina che anche impiegato un’acetilazione chimica completa di tutti i residui di lisina non modificato in proteine con isotopo stabile di etichettatura, ma utilizzato frammento dello ione intensità misurata dal DDA. Nakayasu et al. 14 usato un simile approccio DDA, ma invece utilizzato il rapporto di ioni immonium leggeri e pesanti acetile-lisina per quantificazione. Quantificazione basata sugli ioni frammento, immonium o sequenza ioni (MS2), nella maggior parte dei casi i risultati in meno interferenze di segnale rispetto all’elaborazione ioni precursori peptide intatto (MS1). Tuttavia, quantificazione degli ioni frammento da spettri generati dal DDA MS/MS può soffrono di carenze di campionamento stocastico, dove gli ioni di alta-abbondanza precursore sono più probabili di essere selezionato per MS/MS e quindi, portare ad un campione parziale e incompleto di ioni di precursori.
Questo romanzo del flusso di lavoro4 (Figura 1) utilizza concettualmente un isotopo stabile chimico etichettatura approccio sviluppato originariamente da Baeza et al. 12, tuttavia il flusso di lavoro è successivamente accoppiato con DIA per raccogliere sia precursore e più abbondanza di ioni frammento sopra la massa rilevabile gamma15,16 fornire calcoli accurati stechiometria.
Le aree dei picchi da frammentano ioni che contengono il sito di acilazione di interesse, o ‘differenziazione degli ioni frammento’, vengono utilizzati per quantificare il numero di persone: sito acilazione (Figura 2). Ioni frammento che non contengono la modifica hanno valori identici leggeri e pesanti m/z e sono utilizzati per identificazione del peptide, ma non per la quantificazione. Skyline software17 viene utilizzato per estrarre le aree dei picchi precursore e frammento. La presenza di più ioni frammento contenente un sito determinato acilazione fornisce flessibilità se le interferenze vengono rilevate in alcuni degli ioni frammento. Visualizzazione dei dati in Skyline permette per ispezione critica dei rapporti di ioni frammento di luce pesanti. Oltre alle analisi manuale dei dati, un pacchetto di R open source scritto in-House, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), è stato sviluppato, che utilizza i precursore dello ione e frammento dello ione dati raccolti attraverso DIA e quantifica site-specific acilazione stechiometria da peptidi contenenti più residui di lisina, una caratteristica non è possibile con intensità solo ione precursore misure4.
Questo protocollo viene illustrato anche l’utilizzo di endoproteinase Glu-C, che è specifico per la scissione del C-terminale a residui di acido aspartico e glutammico, anziché tripsina o proteasi Arg-C, come quest’ultimo spesso genera molto grande e potenzialmente moltiplicare acilato proteolitici peptidi derivanti dalla scissione di tripsina bloccati a residui di lisina acilata. Il prodotto chimico procedura di etichettatura è stato ampliato anche uso di anidride succinico (Figura 1), consentendo in tal modo la quantificazione di succinylation stechiometria succinylation. Oltre ai miglioramenti per la preparazione del campione, l’implementazione di frazionamento del peptide da pH offline, base, fase inversa (bRP) separazione dei peptidi ulteriormente diminuita interferenze di quantificazione, consentendo migliori de-convoluzione di Acilazione stechiometria nei campioni di intero proteoma. Insieme, questo metodo presenta e mette in evidenza diversi vantaggi: (1) maggiore efficienza di acilazione di chimica; (2) misurazione della stechiometria succinylation proteina oltre a acetilazione; e (3) una migliore quantificazione precisione. La quantificazione di miglioramento è dovuto le interferenze in diminuzione nei segnali di ioni frammento dal diametro di bRP rispetto al segnale precursore DDA, come pure l’attuazione del pre-frazionamento del peptide off-line.
Questo protocollo fornisce un romanzo e un metodo preciso per quantificare la lisina site-specific acetilazione e occupazione succinylation che può essere applicato a un intero proteoma. Questo metodo si basa sulla misurazione dei peptidi luce endogeni ed esogeni peptidi pesante, il posteriore di quale sono generati in vitro usando acilazione di chimica quantitativa delle proteine con anidride acetica deuterati –d6 o succinico anidride acetica –d4 (Figura 1). Metodi simili hanno usato etichettatura isotopica stabile dei residui di lisina non modificato nativo ed eseguita quantificazione di occupazione di sito basato su entrambi ioni-solo12 o un frammento di ioni precursori da DDA acquisizioni13,14. Questo protocollo applica diversi passaggi durante la preparazione del campione per migliorare l’efficienza di acilazione ed estende l’etichettatura chimica a succinylation. Raccolta dati mediante acquisizioni DIA ottiene sia dello ione precursore e MS2 frammento intensità dello ione sopra l’intera gamma di massa rilevabile, riducendo le interferenze di ioni frammento. Analisi e quantificazione tramite script personalizzati sviluppati internamente e Skyline permettono il calcolo di occupazione del sito per peptidi contenenti più di un residuo di lisina e più acilazione presso un unico sito.
Ci sono diversi passaggi critici durante la fase di preparazione del campione del presente protocollo che deve essere seguito attentamente. Poiché l’intero protocollo si basa su efficiente modificazione chimica di tutti i residui di lisina, questo passaggio è della massima importanza. Anidridi reagiscono con ammine gratis, quindi contenenti molecole buffer o contaminante nel lisato proteico devono essere evitati. Anche durante la fase di chimica per acilazione, assicurarsi che il pH della miscela di reazione è regolato indietro a pH 8 dopo ciascuna delle tre incubazioni con reagente anidride acetica come questa reazione acidifica la miscela e reazioni secondarie O-acilazione possono formare. Inoltre, diluizione 8m contenenti urea miscela di reazione di circa 0,8 M urea prima della digestione e controllando che il pH è compreso nell’intervallo ottima è importante per l’attività ottima di endoproteinase Glu-C. Un altro componente chiave del nostro protocollo è la fase di raccolta dati e l’introduzione di un flusso di lavoro DIA, che supera qualsiasi incoerenza di campionamento dei dati DDA e che permette per la quantificazione a livello di ioni frammento MS2. Uno dei principale vantaggi della metodologia DIA è la diminuzione delle interferenze che in genere sono molto più inclini e problematico nel quantificare il segnale di ione precursore MS1 (come alcune delle pubblicazioni precedenti hanno suggerito).
Diverse modifiche al flusso di lavoro possono essere fatto durante la preparazione di campioni altamente complessi. Il numero delle frazioni riunite dopo il frazionamento di HPLC di controfase basic-pH in linea può essere ridotto per ridurre la complessità del pool di campioni che saranno acquisiti da LC/MS. inoltre, più le sfumature cromatografica può anche essere usato durante acquisizione per consentire per la separazione migliore del peptide. In alternativa, più proteasi possono essere usate per digerire i campioni per produrre una grande varietà di peptidi spaccati e aumentare la copertura dei residui di lisina della proteina. Periodo di prova dura e ottimizzazione può essere condotta usando BSA commerciale contenente specifiche percentuali di acetilazione o succinylation.
Una limitazione al presente protocollo è sopravvalutazione di occupazione sito potenzialmente lieve dovuto dispersi altre modifiche di lisina, come la metilazione o ubiquitinazione, ecc., allo stesso sito4. Calcolato dalle aree dei picchi delle modifiche acil leggeri e pesanti, L/(L+H), l’occupazione del sito è basata sul presupposto che il livello totale di modifica in un sito di lisina è costituito da solo endogeno ‘luce’ acilazione (L) e chimicamente con l’etichetta «pesante» Acilazione (H). Tuttavia, la capienza effettiva totale acilazione presso un sito in vivo può includere altre modifiche di là di acetilazione e/o succinylation. Inoltre, la purezza isotopica segnalata dei reagenti acquistati anidride acetica –d6 (99%) e succinico anidride acetica –d4 (> 98%) può contribuire a una sovrastima piccola di fino a 2% (succinil) o 1% (acetile) della Acilazione endogeno di livello4. Insieme, questi lievi overestimations aggiungere la difficoltà nel quantificare siti con meno di 1% occupazione. Differenze di grande abbondanza tra la completa chimicamente acilato peptidi e i peptidi nativi acilato anche contribuiscono a potenziali errori di quantificazione occupazione sito, soprattutto per basso acilato endogeno peptidi27. Un recente studio di Weinert et al. 27 trovato che abbondanza in diminuzione differenze tra peptidi a-acetilato complete possono ridurre l’ errore di quantificazione27.
Quantificazioni di stechiometria raccolte utilizzando questo protocollo possono individuare importanti acilazione hotspot in una particolare ipotesi di proteina e modulo per esperimenti biologici follow-up, ad esempio di mutagenesi sito-diretta di alcuni siti di interesse. Questo protocollo potrebbe anche rivelare effetti combinati dei siti di stechiometria di acilazione basso che potrebbero esercitare influenze indirette o sottile sulla stabilità strutturale della proteina e localizzata ambienti cellulari. Inoltre, questo protocollo di misura acetilazione e succinylation e altre modifiche di acilazione di lisina possibile di là di acetilazione in modo univoco offrirebbe intuizioni gli effetti dinamici acilazione sulle proteine sotto diversi condizioni biologiche.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da NIH National Institute of Diabetes e digerente e malattie renali NIH-NIDDK concedere R24 DK085610 (PI: E. Verdin). JGM è stata sostenuta da una borsa di studio di NIH T32 (T32 AG000266, PI: J. Campisi). Gli autori riconoscono support da NIH ha condiviso la sovvenzione di strumentazione per il sistema di TripleTOF 6600 a Buck Institute (1S10 OD016281, PI: B.W. Gibson).
aqueous acetic anhydride-d6 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 175641-1G | 1% isotopic purity |
succinic anhydride-d4 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 293741 | 2% isotopic purity |
sequencing grade endoproteinase Glu-C | Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) | 10791156001 | 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt) |
Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT 094225 | |
HPLC acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH015-4 | |
HPLC grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH365-4 | |
iodoacetamide | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
FLUKA formic acid (FA) for mass spec | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | C988C27 | ~98% |
urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
bovine serum albumin (BSA) | Pierce, Rockford, IL, USA | 88341 | |
triethylammonium bicarbonate (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408-100ML | |
anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | 43998 | |
sodium hydroxide (NaOH) | EMDMillipore, Burlington, MA, USA | SX0590 | |
50% hydroxylamine solution in water | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 438227-50ML | |
LC-MS grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC365-4 | |
LC-MS acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC015-4 | |
Eppendorf Themomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 | |
Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer | Labconco, Kansas City MO, USA | 7751000 | |
indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | model# 845 | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 |