Här presenterar vi objektiv kvantifiering av platsspecifika protein acetylering eller succinylation beläggning (stökiometri) av en hela proteomet genom en proportionerlig analys av endogena ändringar ändringar som införts efter kvantitativa kemiska acylation med stabil isotop-märkt anhydrider. I kombination med känsliga data-oberoende förvärv masspektrometri erhålls korrekt webbplats beläggning mätningar.
Posttranslationella modifieringen (PTM) av protein lysin rester av NƐ– acylation inducerar strukturella förändringar som kan dynamiskt reglerar protein funktioner, till exempel genom att ändra enzymatisk aktivitet eller genom att medla interaktioner. Exakt kvantifiering av platsspecifika protein acylation beläggning eller stökiometri, är viktigt för att förstå de funktionella konsekvenserna av både globala lågaktivt stökiometri och enskilda high-level acylation stökiometri av specifika lysin rester. Andra grupper har rapporterat mätning av lysin acetylering stökiometri genom att jämföra förhållandet mellan peptid föregångare isotoperna från kroppsegna, naturliga överflöd acylation och exogena, tunga isotop-märkt acylation infördes efter kvantitativa kemiska acetylering av proteiner med stabil isotop-märkt ättiksyraanhydrid. Det här protokollet beskriver en optimerad strategi med flera förbättringar, inklusive: (1) ökad kemisk acylation effektivitet, (2) förmågan att mäta protein succinylation förutom acetylering, och (3) förbättrad kvantitativ noggrannhet beror på reducerade störningar med fragment ion kvantifiering från data-oberoende förvärv (DIA) i stället för föregångare ion signal från data-beroende förvärv (DDA). Användningen av extraherade peak områden från fragmentet joner för kvantifiering ger också unikt differentiering av webbplatsnivå acylation stökiometri från proteolytiska peptider som innehåller mer än en lysin rester, vilket inte är möjligt med hjälp av föregångare ion signaler för kvantifiering. Datavisualisering i Skyline, en öppen källkod Kvantitativ proteomik miljö, möjliggör bekväm uppgiftskontroll och granskning. Tillsammans, erbjuder detta arbetsflöde opartisk, exakt och korrekt kvantifiering av platsspecifika lysin acetylering och succinylation beläggning av en hela proteomet, vilket kan avslöja och prioritera biologiskt relevanta acylation platser.
NƐ– acylation av protein lysin rester är en viktig regulator av proteinfunktion. Lysin acetylering och andra acylations, såsom succinylation, malonylation och glutarylation, tros reglera ämnesomsättning, cell signalering och andra cellulära processer1,2,3,4 , och få konsekvenser i metabola sjukdomar5. Många studier har funnit att lysin acyl ändringar genomgå stora vik-förändringar under olika förhållanden i däggdjur vävnader och cell linjer5,6,7,8 som bakterier9,10,11, dock dessa relativa fold förändringar inte ger insikter i hur stor andel av den totala protein modified. Studier rapportering mätningar av acylation webbplats beläggning är knappa12,13,14, trots betydelsen och behovet av sådana studier eftersom de ger mer detaljerat än relativa vik ändra. Till exempel kunde en 10-faldig förändring representera en webbplats beläggning ökning från 0,01 till 0,1%, 1 till 10% eller ens 10 till 100%. Exakta stökiometri mätningar krävs att tolka biologiska betydelsen av acylation och förutsäga påverkan angående omfattningen av protein strukturella, och möjligen, funktionella förändringar.
En tidigare metoden att kvantifiera webbplats beläggning utnyttjar tung stabil-isotope kemisk märkning av oförändrad lysin rester följt av masspektrometri att mäta förhållandet mellan endogena ”light” acetylering i jämförelse med den exogena, kemiskt-märkt ”tunga” acetyl-lysin använder föregångare ion stödnivåer12. En annan färsk studie av Zhou et al. 13 beskrivs ett liknande tillvägagångssätt för att bedöma lysin acetylering stökiometri som också sysselsatt en fullständig kemisk acetylering av alla omodifierade lysin restprodukter i proteiner med stabil isotop märkning, men används fragment ion stödnivåer mätt som DDA. Nakayasu et al. 14 används ett liknande DDA tillvägagångssätt, men i stället förhållandet mellan lätta och tunga acetyl-lysin immonium joner för kvantifiering. Rapporteringsgräns baserat på fragmentet joner, immonium eller sekvens joner (MS2), i de flesta fall resulterar i mindre signal störningar jämfört med bearbetning intakt peptid föregångare joner (MS1). Kvantifiering av fragmentet joner från DDA-genererade MS/MS spectra kan dock lider stokastiska provtagning brister, där hög-överflöd föregångare jonerna är mer benägna att väljas för MS/MS och således leda till en ensidig och ofullständig provtagning av föregångaren joner.
Denna roman arbetsflöde4 (figur 1) använder begreppsmässigt en stabil isotop kemisk märkning strategi som ursprungligen utvecklades av Baeza et al. 12, men arbetsflödet är därefter tillsammans med DIA att samla både föregångare och flera fragment ion sammansättning över detekterbara massan variera15,16 ger exakta stökiometri beräkningar.
Topp områden från fragment joner som innehåller webbplatsen acylation av intresse, eller ‘skilja fragment joner’, används för att kvantifiera acylation webbplats beläggning (figur 2). Fragmentet joner som inte innehåller ändringen har identiska lätta och tunga m/z-värden, och används för identifiering av peptid men inte för kvantifiering. Skyline software17 används för att extrahera föregångare och fragment peak områden. Förekomsten av flera fragment joner som innehåller en viss acylation webbplats ger flexibilitet om störningar upptäcks vissa fragment jonerna. Datavisualisering i Skyline möjliggör kritisk inspektion av ljus-till-heavy fragment ion nyckeltal. Förutom manuell dataanalys framkallades en öppen källkod R package skriftligt in-house, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), som använder föregångare ion och fragment ion data som samlas in via DIA och kvantifierar platsspecifika acylation stökiometri från peptider som innehåller flera lysin, en funktion som inte är möjligt med föregångaren endast ion-intensitet mätningar4.
Detta protokoll visar också användningen av endoproteinase Glu-C, som är specifik för C-terminal klyvning på glutaminsyra och asparaginsyra rester, istället för att använda trypsin eller Arg-C proteas, som den senare ofta generera mycket stora och potentiellt multiplicera acylated proteolytiska peptider följd blockeras trypsin klyvning på acylated lysin rester. Kemisk märkning förfarande var också utvidgas till att omfatta användning av succinic anhydride (figur 1), vilket möjliggör kvantifiering av succinylation stökiometri succinylation. Förutom förbättringar av provberedningen, genomförandet av peptid fraktionering av offline, grundläggande pH, minskade omvänd fas (bRP) separation av peptider ytterligare kvantifiering störningar, så att bättre koppla faltning av acylation stökiometri i hela proteomet prover. Tillsammans, denna metod har och belyser flera fördelar: (1) ökad effektivitet av kemiska acylation; (2) mätning av protein succinylation stökiometri förutom acetylering; och (3) förbättrad kvantifiering noggrannhet. Förbättrad kvantifieringen är på grund av minskade störningar i fragment ion signaler från DIA jämfört med DDA föregångare signal, samt genomförandet av off-line peptid före fraktionering av bRP.
Detta protokoll ger en ny och exakt metod för att kvantifiera platsspecifika lysin acetylering och succinylation beläggning som kan tillämpas på en hela proteomet. Denna metod förlitar sig på mätning av endogena ljus peptider och exogena tunga peptider, varav den senare är genererade i vitro med kvantitativa kemiska acylation av proteiner med deutererade ättiksyra anhydrid –d6 eller Succinic anhydride –d4 (figur 1). Liknande metoder har använt stabil isotopiska märkning av infödda omodifierade lysin rester och utfört webbplats beläggning kvantifiering baserat på antingen föregångare ion-bara12 eller fragment joner från DDA förvärv13,14. Detta protokoll gäller flera steg under provberedning acylation effektivitetsförbättringar och utökar det kemiska märkning till succinylation. Datainsamling med DIA förvärv erhåller både föregångare ion och MS2 fragment ion stödnivåer över hela detekterbara massa intervallet, vilket minskar fragment ion störningarna. Analys och kvantifiering via Skyline och anpassade skript egenutvecklade tillåter webbplatsen beläggning beräkningen för peptider som innehåller mer än en lysin rester och mer än en acylation på en plats.
Det finns flera kritiska steg under förberedelsestadiet prov av detta protokoll som bör följas noggrant. Eftersom hela protokollet är beroende av effektiv kemisk modifiering av alla lysin rester, är detta steg av yttersta vikt. Anhydrider reagerar med gratis aminer, så amine-innehållande buffert eller främmande molekyler i proteinet lysate måste undvikas. Också under kemiska per-acylation steg, se till att pH-värdet i reaktionsblandningen justeras tillbaka till pH 8 efter varje av de tre inkubationer med ättiksyraanhydrid reagens som denna reaktion försurar blandningen, och O-acylation-sidoreaktioner kan bilda. Utspädning av 8 M urea-innehållande reaktionsblandningen att runt 0,8 M urea innan matsmältningen och kontrollera att pH-värdet ligger inom intervallet som optimal är dessutom viktigt för optimal aktiviteten av endoproteinase Glu-C. En annan viktig komponent i våra protokoll är steget data insamling och införandet av ett DIA arbetsflöde, som övervinner inkonsekvenser DDA datasampling och vilket möjliggör kvantifiering på MS2 fragment ion nivå. En huvudsaklig fördel av metoden DIA är minskningen av störningar som vanligtvis är mycket mer benägna och problematiskt när kvantifiera MS1 föregångare ion signalen (som några av de tidigare publikationerna har föreslagit).
Flera ändringar i arbetsflödet kan göras när du förbereder mycket komplexa prover. Antalet fraktioner poolade efter den offline basic-pH omvänd fas HPLC fraktioneringen kan minskas för att sänka komplexiteten i de poolade prover som kommer att förvärvas av LC/MS. dessutom längre kromatografiska övertoningar kan också användas under förvärv som möjliggör bättre peptid separation. Alternativt, flera proteaser kan användas för att smälta prov för att producerar en större mängd klyvs peptider och öka täckningen av protein lysin rester. Trial körs och optimering kan genomföras med hjälp av kommersiella BSA som innehåller specifika procentsatser av acetylering eller succinylation.
En begränsning till detta protokoll är potentiellt liten webbplats beläggning överskattningen beror på oredovisad andra ändringar, lysin, till exempel metylering eller ubikvitinering, etc., på samma plats4. Beräknas från peak områden i lätta och tunga acyl ändringar, L/(L+H), är webbplats beläggningen baserat på antagandet att den totala nivån på modifiering vid en lysin webbplats består av endast endogena ‘ljus’ acylation (L) och kemiskt märkt ‘tung’ acylation (H). Dock kan den faktiska totala acylation beläggningen på en webbplats i vivo omfatta andra ändringar utöver acetylering och/eller succinylation. Dessutom rapporterade isotopiska renheten av köpta reagenser ättiksyra anhydrid –d6 (99%) och succinic anhydride –d4 (> 98%) kan bidra till en liten överskattning av upp till 2% (succinyl) eller 1% (acetyl) av den endogena acylation nivå4. Tillsammans, dessa smärre overestimations lägga till svårigheten att kvantifiera platser med mindre än 1% beläggning. Stort överflöd skillnader mellan den kompletta kemiskt acylated peptider och de infödda acylated peptiderna också bidra till potentiella webbplats beläggning kvantifieringsfel, särskilt för låg endogen acylated peptider27. En färsk studie av Weinert et al. 27 funnit att minskad överflöd skillnader mellan komplett per-acetylerade peptider kan minska de kvantifiering fel27.
Stökiometri kvantifieringar samlades använder det här protokollet kan peka ut viktiga acylation hotspots i ett särskilt protein och form hypoteser för biologiska uppföljande experiment, såsom webbplats riktad mutagenes av vissa platser av intresse. Detta protokoll kan också avslöja kombinerade effekterna av låga acylation stökiometri webbplatser som kunde utöva indirekt eller subtila influenser på protein strukturella stabilitet och lokaliserade cellulära miljöer. Dessutom skulle genomförandet av detta protokoll att mäta acetylering och succinylation och andra möjliga lysin acylation ändringar utöver acetylering unikt erbjuda insikter i dynamiska acylation effekter på proteiner under olika biologiska förutsättningar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av NIH nationella institutet för Diabetes och mag- och njur sjukdomar NIH-NIDDK bevilja R24 DK085610 (PI: E. Verdin). JGI stöddes av en NIH T32 fellowship (T32 AG000266, PI: J. Campisi). Författarna erkänner stöd från NIH gemensamma instrumentation bidrag för TripleTOF 6600 systemet vid Buck Institute (1S10 OD016281, PI: B.W. Gibson).
aqueous acetic anhydride-d6 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 175641-1G | 1% isotopic purity |
succinic anhydride-d4 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 293741 | 2% isotopic purity |
sequencing grade endoproteinase Glu-C | Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) | 10791156001 | 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt) |
Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT 094225 | |
HPLC acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH015-4 | |
HPLC grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH365-4 | |
iodoacetamide | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
FLUKA formic acid (FA) for mass spec | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | C988C27 | ~98% |
urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
bovine serum albumin (BSA) | Pierce, Rockford, IL, USA | 88341 | |
triethylammonium bicarbonate (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408-100ML | |
anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | 43998 | |
sodium hydroxide (NaOH) | EMDMillipore, Burlington, MA, USA | SX0590 | |
50% hydroxylamine solution in water | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 438227-50ML | |
LC-MS grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC365-4 | |
LC-MS acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC015-4 | |
Eppendorf Themomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 | |
Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer | Labconco, Kansas City MO, USA | 7751000 | |
indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | model# 845 | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 |