Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별

Summary

위성 세포의 정확한 식별 다양 한 생리 및 병 적인 조건 하에서 그들의 기능을 공부 하는 것이 필수적입니다. 이 문서는 얼룩 면역 형광 기반으로 성인 골격 근육 섹션에 위성 셀을 식별 하는 프로토콜을 제공 합니다.

Abstract

면역 형광 검사 조직 섹션에 다른 세포 유형을 식별 하는 데 도움이 효과적인 방법입니다. 원하는 셀 인구를 공부 하기 위하여 특정 셀 표식에 대 한 항 체는 조직 섹션에 적용 됩니다. 성인 골격 근육 인공위성 세포 (SCs)는 근육 수리 및 재생에 기여 하는 줄기 세포 이다. 따라서, 그것은 시각화 하 고 다른 생리 적인 조건 하에서 위성 세포 인구를 추적 하는 것이 중요입니다. 골격 근육을 휴식, SCs 기저 lamina 및 myofiber 플라즈마 멤브레인 사이 상주 합니다. SCs는 myofibers 또는 세포 배양에서 식별 하는 데 일반적으로 사용 되 마커 Pax7 짝된 상자 단백질입니다. 이 문서에서는, 골격 근육 부분에 최적화 된 Pax7 면역 형광 검사 프로토콜은 일반적인 얼룩 및 백그라운드를 최소화 하 여. 기저 lamina의 단백질 (laminin)를 인식 하는 또 다른 항 체도 SCs 유사한 프로토콜을 식별 하는 데 사용할 수 있습니다 또한 더블 또는 트리플 Pax7 및 관심사의 추가적인 단백질을 위한 항 체와 라벨을 수행 하기 위해 추가 되었다.

Introduction

골격 근육 multinucleated 근육 세포의 구성, myotubes 이라고, myofibers, 힘 및 수 축을 통해 움직임을 생성 하는 구성. Craniofacial 일부 근육을 제외 하면 대부분 골격 근육 somite¹라고 하는 임시 미 발달 구조에서 파생 됩니다. 조직적 전조 세포 상피 somite myoblasts 될에서 delaminate. 더 Myoblasts myocytes 멀티 nucleated myofibers를 myotubes 될 융합으로 구분 합니다. 위의 과정은 myogenesis 이라고 불리고 일시적으로 통제 제어 유전자 발현의 특징 이다. 조직적 선구자 표현할 Pax3 Pax7, 반면 myoblasts 익스프레스 MyoD 또는 Myf5 myocytes 익스프레스 myogenin myosins^2,3. 근육 성장 있는 myofibers 될 큰 근육 섬유 크기 (비 대)⁴증가 기존 섬유 (증식)에 더 많은 myonuclei를 통합 하는 프로세스입니다. 근육 성장, 동안 줄기 세포 속성을 차별화 하 고 자기 갱신 수에 있는 조직적 셀의 지속 가능한 소스가입니다. 이 세포는 위성 세....

Protocol

이 프로토콜에서 성인 쥐 (2-6 개월), tibialis 앞쪽 (TA) 및 신 근 digitorum longus (EDL)의 앞쪽 뒷 다리 근육 그들의 SCs에 얼룩 면역 형광 검사를 수행 하려면 예제로 채택 되었다. 모든 단계 마우스 및 근육 조직 해 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) NIAMS/NIH에 의해 승인 되었습니다.

1. 마우스 뒷 다리에서 따/EDL 근육 해 부

1. NIH의 ACUC의 지침에 따라 CO₂ 채워진된 안락사 챔버에 마우스 안락사 필요한 경우 자 궁 경부 전위를 수행 합니다.
2. 위에 마우스 얼굴 업 해 부 패드 (부정사). 복 부 피부에 70% 에탄올 스프레이. 마우스 배 스킨의 중앙에 가로로 여 1-2 cm를 잘라 다음 마우스 피트를 향해 개방을 당겨서 마우스를 deskin. 마우스 뒷 다리 사지의 한쪽을 노출 합니다.
3. 두 개의 날카로운 집게를 사용 하 여: 발목, TA/EDL을 연결 하는 힘 줄을 하나를 사용 하 고 다른 하나를 사용 하 여 휴식을 전단 TA/EDL을 취재 하는 근 막. 일단 근 막 벗는 집게의 날카로운 팁을 사용 하 여 TA/EDL 근육 아래 팁을 실행 하 여 TA/EDL 경골 뼈에서 분리.
4. 여전히는 집게....

Results

위의 단계에 따라 SCs 성공적으로 성인 휴식 근육 섹션 형광 현미경 (그림 1)의 밑에 구상 될 수 있다. 비록 성인 근육 조직 섬유의 특정 유형에 서 강한 자동 형광 있다, 밝은 알 렉 사 시리즈 염료 배경 잡음을 극복할 수와 신호 밖으로 서 (그림 1A, B, 화살표 머리). 두 광자 공초점 현미경 넓은 분야 형광 현미경 (그림 1A) 보다 상대적으로 깔끔한 이미지를 (그림 1B)를 캡처합니다. 동일한 프로토콜 또한 청소년 생쥐 (그림 2A), 마우스 배아 (그림 2B)의 근육 조직에서 잘 작동 하 고 부상 성인 근육 .......

Discussion

위의 프로토콜 Pax7/MF20 zebrafish 골격 근육¹²얼룩의 방법에 근거 했다. 사용 하 고 단계 차단 솔루션은 동일 하거나 유사한. 사용 하는 항 체는 동일 합니다. 조정된 단계 마우스 근육 조직과 SCs의 기능에 근거 했다. 첫째, 항 체 Laminin 시각화 하 고 SCs의 위치를 확인할 수 있도록 믹스에 추가 되었습니다. 그것은 특히 도움이 488/555;의 듀얼 필터 큐브를 사용 하 여 현미경 SCs의 수를 계산 하 이 크게 시끄러운 autofluorescent 배경에서 밖으로 서 SC 파생 Pax7 신호를 향상. 둘째, 사용 Pax7 항 체는 마우스 항 체 이기 때문에, 우리는 마우스에 마우스 차단 단계 (5.3)을 줄이기 위해 마우스 IgG의 불특정 바인딩에서 발생 배경 추가. 셋째, 항 원 검색 단계 (단계 5.2) 조직을 고정 하는 PFA에 Pax7 항 체와 얼룩에 대 한 중요 했다.

동일한 프로토콜 (강아지와 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
methylbutane	Sigma-Aldrich	M32631
최적 절단 온도(O.C.T.) 화합물	전자 현미경 과학	62550-01
10x PBS	Gibco, Themo Fisher	70011-044
16% PFA	TED PELLA	50-00-0
Triton-100	Sigma-Aldrich	T8787
일반 염소 혈청	Thermo Fisher	0 1-6201
AffiniPure Fab Fragment 염소 안티 마우스 IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	115-007-003
20x 구연산염 완충액	Thermo Fisher	00 500
Pax7 단클론 마우스 항체(IgG1)(상등액)	발달 연구 하이브리도마 은행	N/A
라미닌 다클론 토끼 항체	Sigma-Aldrich	L9393
MF20 단클론 마우스 항체(IgG2b)(상등액)	발달 연구 하이브리도마 Bank	N/A
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary 항체, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A-21121
Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary 항체, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher	A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsobed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555	Thermo Fisher	A32732
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